Identificación de una profunda

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4354 (2023) Citar este artículo

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Se ha propuesto que las primeras bacterias, o incluso el último ancestro común universal de todas las células, eran termófilas. Sin embargo, la investigación sobre el origen y la evolución de la termofilia se ve obstaculizada por las dificultades asociadas con el aislamiento de microorganismos termófilos de ramificación profunda en cultivo puro. Aquí, aislamos una bacteria termófila de ramificación profunda de un respiradero hidrotermal de aguas profundas, utilizando una estrategia de cultivo de dos pasos ("Resta-Subóptima", StS) diseñada para aislar organismos raros. La bacteria, que llamamos Zhurongbacter thermophilus 3DAC, es un heterótrofo reductor de azufre que está filogenéticamente relacionado con Coprothermobacterota y otros grupos bacterianos termófilos, formando un clado que parece representar un linaje bacteriano importante y de divergencia temprana. El antepasado de este clado podría ser una bacteria termófila, estrictamente anaeróbica, móvil, dependiente de hidrógeno y mixotrófica. Por tanto, nuestro estudio proporciona información sobre la evolución temprana de las bacterias termófilas.

Los organismos con temperaturas óptimas de crecimiento superiores a 45 °C se denominan termófilos1,2. Estos termófilos se distribuyen ubicuamente en entornos naturales o artificiales de alta temperatura, como sitios volcánicos terrestres, fuentes termales, sistemas hidrotermales submarinos, fondos submarinos profundos, depósitos de petróleo, suelos superficiales calentados por energía solar e incubadoras industriales3,4,5,6,7. 8. Algunos termófilos también pueden vivir en condiciones alcalinas, ácidas o de alta salinidad, lo que destaca su capacidad para tolerar múltiples factores estresantes9,10. Estos llamados “ambientes extremos” generalmente se consideran análogos de las condiciones existentes en la Tierra primitiva cuando la vida se originó a finales del Hadeano o principios del Arcaico11,12, y múltiples estudios experimentales13,14 y evidencia geológica15 respaldaron el origen temprano de los termófilos.

Las bacterias termófilas se pueden encontrar en una amplia gama de filos bacterianos, sin embargo, solo unos pocos filos contienen casi exclusivamente bacterias termófilas, a saber, Aquificota, Dictyoglomota, Coprothermobacterota, Thermotogota y Thermodesulfobiota. Si bien se ha sugerido que la termofilia podría representar una característica ancestral de las bacterias o incluso de la vida16,17,18,19,20, otras hipótesis han propuesto un origen no termófilo de las bacterias y han colocado linajes bacterianos como Chloroflexota o Candida Candida Phyla Radiation. (CPR) cerca de la raíz del árbol filogenómico bacteriano21,22,23. Un estudio reciente que utilizó un enfoque de reconciliación de árboles y especies de genes libres de grupos externos rechazó las raíces bacterianas previamente predichas y colocó una nueva raíz robusta entre dos ramas bacterianas principales, es decir, Gracilicutes y Terrabacteria, aunque con incertidumbres con respecto a la posición filogenética del linaje Fusobacteriota24 . Sin embargo, aún no está claro cuándo se originaron las bacterias termófilas y cómo evolucionó su metabolismo.

El potencial metabólico previsto del último ancestro común bacteriano (LBCA) o del linaje bacteriano divergente temprano puede arrojar luz sobre los entornos terrestres primitivos y los ecosistemas primitivos20,25,26,27,28. Para las bacterias termófilas, varios estudios previos centrados en diferentes linajes como Thermotogota29, Aquificota30 y Coprothermobacterota31 revelaron una historia evolutiva compleja con una alta proporción de genes transferidos horizontalmente desde otros procariotas. Sin embargo, todavía falta un estudio evolutivo basado en análisis genómicos comparativos completos de los principales clados bacterianos termófilos. Aunque los análisis metagenómicos sin cultivo han ampliado enormemente nuestro conocimiento sobre la diversidad bacteriana32,33, la investigación sobre bacterias termófilas todavía requiere cepas aisladas para proporcionar evidencia directa de su fisiología, como la temperatura óptima de crecimiento para confirmar sus características termófilas. Sin embargo, es extremadamente difícil obtener nuevas bacterias termófilas cultivadas puramente, especialmente para clados de ramificación profunda.

Aquí, informamos el descubrimiento y aislamiento de una nueva cepa bacteriana termófila, piezófila y reductora de azufre, Zhurongbacter thermophilus 3DAC. Los estudios filogenómicos de la cepa 3DAC indican que está estrechamente relacionada con los principales grupos de bacterias termófilas, como Coprothermobacterota, Dictyoglomota, Caldisericota y Thermotogota. Los análisis ancestrales filogenéticos indican que estos linajes bacterianos termófilos estrechamente agrupados comparten un último ancestro común con el potencial de metabolizar hidrógeno, compuestos de azufre y con catabolismo mixotrófico de carbono.

Para aumentar la probabilidad de cultivar nuevas bacterias termófilas de la rara biosfera, diseñamos una estrategia de cultivo en dos etapas, denominada estrategia de "Resta-Subóptima" (StS) (Fig. 1c). El concepto de este método es reducir la complejidad de la comunidad y minimizar la abundancia de organismos heterótrofos dominantes utilizando primero un medio de cultivo autótrofo y subcultivando varias veces (denominado “Resta”), seguido de cambiar a un medio heterótrofo rico a una velocidad temperatura subóptima para recuperar las bacterias termófilas heterótrofas objetivo presentes en baja abundancia y para evitar la competencia de arqueas heterótrofas hipertermófilas de rápido crecimiento, generalmente dominantes (denominadas "Subóptimas").

a Ubicación del respiradero L en el campo de respiradero 9°N en la Dorsal del Pacífico Oriental. El mapa fue generado por Ocean Data View (Schlitzer, Reiner, Ocean Data View, https://odv.awi.de, 2021). b La muestra negra de la chimenea con ventilación en L recogida en un tubo anaeróbico. c Diagrama esquemático de la estrategia "Resta subóptima" (StS) utilizada para aislar la cepa 3DAC de Zhurongbacter thermophilus en este estudio. d El seguimiento de los cambios de proporción de secuencias estrechamente relacionadas con 3DAC en la muestra de chimenea, enriquecimiento original y diferentes transferencias. Etiquetas: Chimenea, la muestra de chimenea; CH8-50C-S0, enriquecimiento original; CH8-50C-S1 a -S5, los subcultivos primero a quinto transferidos del enriquecimiento original. Todas las muestras indican que la cepa 3DAC representa una especie rara. e Micrografía electrónica de transmisión de 3DAC, en la que las células 3DAC forman largos filamentos con cadenas de hasta 11 células o más; la micrografía que muestra una conexión entre dos celdas 3DAC; y un flagelo lateral largo de 3DAC. El experimento TEM se repitió cuatro veces y cada vez se observaron patrones filamentosos largos. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

En este caso, la muestra original, recolectada de una chimenea de humo negro activa que emite fluido hidrotermal con una temperatura de 231 °C (Fig. 1a, b; ref. 34), se cultivó primero en un medio quimiolitoautotrófico (medio SME, ver “ Métodos”) a 50 °C, luego transferidos consecutivamente cinco veces en condiciones autótrofas, reduciendo la complejidad de la comunidad microbiana y la proporción de heterótrofos. Las condiciones de la etapa quimioautótrofa de “Resta” imitaron el entorno natural in situ y establecieron una comunidad dominada por autótrofos (principalmente Hydrogenimonas dentro de Campylobacterota y Desulfurobacterium dentro de Aquificota)35. Funcionó de manera similar al método de enriquecimiento tradicional al disminuir la proporción de heterótrofos, pero mantuvo los heterótrofos cocultivados con los autótrofos. En general, si bien la comunidad se simplifica mediante la etapa de “Resta”, aún mantiene un cierto grado de diversidad, brindando más oportunidades para el aislamiento de especies raras sustentadas por autótrofos.

Para la etapa "Subóptima", cambiamos la condición de cultivo del medio autótrofo a un medio heterótrofo para proporcionar una fuerte selección de heterótrofos. Sin embargo, disminuimos la temperatura de cultivo de 50 a 45 °C. Si bien esto resultó en una temperatura de crecimiento subóptima para las bacterias termófilas, impidió el crecimiento de arqueas hipertermófilas heterótrofas (es decir, Thermococcus, la temperatura de crecimiento oscila entre 50 y 100 °C36), que estaban omnipresentes en la muestra de la chimenea, permitiendo la recuperación de bacterias heterótrofas raras. bacterias termófilas. Después de una incubación de cuatro días, se observó crecimiento, seguido del aislamiento de colonias individuales transparentes y redondas utilizando el método del tubo rodante37 que contiene un medio TRM sólido.

Durante la etapa de "Resta", se pueden retener algunas especies heterótrofas de baja abundancia cocultivadas con los autótrofos; estas especies raras difícilmente pueden aislarse mediante métodos tradicionales cuando están presentes microorganismos heterótrofos de rápido crecimiento al mismo tiempo. El aislamiento exitoso de la cepa 3DAC, que representó solo ~0,001% de la comunidad total en la quinta transferencia del enriquecimiento quimioautótrofo (~0,2% en la muestra de chimenea, Fig. 1d), resalta el potencial de la estrategia "StS" para aislar especies raras de muestras ambientales.

Aquí proporcionamos una nueva idea de una estrategia de dos pasos para lograr el aislamiento de especies raras o desconocidas que tienen un nicho ecológico similar al de un grupo dominante. El proceso de “Resta” realiza una dilución hasta la extinción dentro de una comunidad para realizar la simplificación de la composición microbiana, y el proceso “Subóptimo” recupera las especies raras por la condición subóptima que es más dañina para el grupo dominante en un nicho ecológico similar. . Esta estrategia "StS" puede brindar nuevas oportunidades para descubrir taxones raros escondidos detrás de los taxones dominantes comunes en los entornos estudiados.

Las células de la cepa 3DAC tienen forma de bastón, de 1,3 a 7,5 μm de largo (promedio de 3,1 ± 1,3, n = 25) y de 0,4 a 0,6 μm de ancho (promedio de 0,5 ± 0,07, n = 25). Tienen un único flagelo lateral y son muy móviles bajo el microscopio óptico. Durante el crecimiento, la cepa 3DAC se presenta principalmente como células individuales, pero a veces forma cadenas largas (Fig. 1e y Fig. 1 complementaria). La cepa 3DAC crece sólo en condiciones estrictamente anaeróbicas y se comporta como un termófilo piezófilo con: rango de temperatura de 30 a 75 °C (óptimo 70 °C), rango de NaCl de 1,0 a 4,5 % (p/v) (óptimo 2,5 %), Rango de pH de 5,5 a 8,5 (pH óptimo 7,0) y rango de presión hidrostática de 0,1 a 80 MPa (óptimo 20 MPa) (Figuras complementarias 2a a d).

La adición por separado de peptona, casaminoácidos, extracto de carne, extracto de levadura y triptona a una concentración final de 0,2% (p/v) apoyó el rápido crecimiento de la cepa 3DAC (Figura complementaria 2e). En un medio TRM basal sin fuente de carbono, no se detectó crecimiento al agregar por separado solo un tipo de carbohidrato o ácido orgánico (ver "Métodos") en las condiciones probadas. Sin embargo, la cepa 3DAC creció bien con 20 aminoácidos canónicos agregados simultáneamente al medio TRM basal. Además, los experimentos de "dejar uno fuera" con 20 aminoácidos revelaron que 3DAC se basaba en 11 aminoácidos esenciales (es decir, l-arginina, l-cisteína, l-histidina, l-leucina, l-lisina, l-metionina, l-fenilalanina, l-prolina, l-treonina, l-triptófano y l-tirosina) (Fig. 2b), no se observó crecimiento debido a la ausencia de cualquiera de estos aminoácidos. En presencia de 20 aminoácidos, se pueden utilizar d-(+)-glucosa y piruvato como fuentes de carbono adicionales (Fig. 2b y Datos complementarios 1).

a Diagrama esquemático del proceso energético en la cepa 3DAC. Las formas rojas representan ortólogos de arqueas. Las formas grises representan ortólogos bacterianos. Las líneas continuas representan reacciones enzimáticas. Las líneas de puntos representan reacciones abióticas. Los genes expresados ​​diferencialmente se identificaron utilizando DESeq2 (versión 1.12.4). Se aplicó la función DESeq predeterminada con betaPrior = FALSE, en la que se realizó un modelo binomial generalizado negativo con la prueba de significancia de Wald. Los valores de p bilaterales se corrigieron para pruebas múltiples utilizando el método de Benjamini-Hochberg. Las flechas azules indican una regulación significativa hacia arriba o hacia abajo con azufre en el medio de cultivo según los datos transcriptómicos [n = 3 por tratamiento, log2 (cambio de veces)> 1, valor de P <0,05] (Datos complementarios 1). Esta figura fue creada usando BioRender (https://biorender.com/). b Capacidades de crecimiento en diversas fuentes de carbono de la cepa 3DAC. Las predicciones computacionales fueron simuladas mediante el modelo metabólico a escala genómica de 3DAC (Datos complementarios 1). “20aa”: los 20 aminoácidos suplementados como única fuente de carbono. “20aa-X”: eliminación de aminoácidos individuales X. “20aa+Y”: fuente de carbono extra Y suministrada con 20 aminoácidos. “+”: rendimientos de crecimiento similares en comparación con la condición 20aa; “++”: rendimientos de crecimiento al menos 1,5 veces mayores que 20aa; "-": sin crecimiento. c Concentración de sulfuro y DO600 durante el crecimiento de la cepa 3DAC. S: medio con azufre elemental; NS: sin azufre elemental. Las barras de error representan las desviaciones estándar (DE) de triplicados biológicos independientes (n = 3) durante los experimentos bajo 0,1 MPa. Los datos se presentan como valores promedio ± DE. d Rendimientos de crecimiento experimentales y computacionales de la cepa 3DAC mediante la utilización de varias especies de azufre. En el grupo experimental, las barras de error representan las desviaciones estándar (DE) de duplicados biológicos independientes (n = 2) durante los experimentos bajo 0,1 MPa. Los datos se presentan como valores promedio ± DE. e Simulaciones de 3DAC (WT) de tipo salvaje, eliminaciones simples (-MBS, -Nfn2, -SH1), eliminaciones dobles (-MBS-Nfn2, -MBS-SH1 y -Nfn2-SH1) y eliminaciones triples (-MBS-Nfn2 -SH1) de complejos derivados de arqueas en procesos energéticos en 3DAC. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

El genoma completo de la cepa 3DAC es un cromosoma circular único de 1.588.679 pb con un contenido de GC del 41,15% (Figura complementaria 3). El genoma 3DAC contiene tres operones del gen rRNA y 46 genes de tRNA. Se pueden identificar un total de 1.524 secuencias de ADN codificantes (CDS) con una longitud media de 980,78 pb, que cubren el 94,09% de todo el genoma. La cepa 3DAC tiene una vía de glucólisis completa, lo que sugiere una capacidad de utilización de carbohidratos, pero muchos genes relacionados con la síntesis de aminoácidos están ausentes, lo que indica la necesidad de ciertos aminoácidos. Este fenómeno se confirma con los resultados de experimentos fisiológicos; el crecimiento de 3DAC depende de la adición de aminoácidos y puede estimularse agregando carbohidratos (Fig. 2b). La pérdida de genes relacionados con la síntesis de aminoácidos es común entre los termófilos. Dado que la síntesis de aminoácidos consume mucha energía38, es más eficiente para los termófilos absorber aminoácidos directamente del medio ambiente, lo que favorece más su adaptación al medio hidrotermal.

El proceso energético respiratorio en la cepa 3DAC contiene una ATP sintasa impulsada por Na+ (Figura complementaria 4), un grupo de 12 genes que codifica un complejo productor de hidrógeno (MBH) unido a la membrana y un grupo de 13 genes que codifica el azufre unido a la membrana. complejo respiratorio (MBS), que es similar al proceso energético en arqueas hipertermófilas dentro del orden Thermococcales39,40,41 (Fig. 2a). MBS permite a las células reducir el azufre elemental (S0) a sulfuro de hidrógeno (H2S) in vivo y utilizar ferredoxina reducida como donante de electrones40. Los genes en MBH de 3DAC, incluida la subunidad catalítica clave de la producción de hidrógeno (MbhL), son ortólogos bacterianos, como se esperaba, mientras que la mayoría de los genes codificantes de MBS (10 de 13) de 3DAC son ortólogos de arqueas que codifican el brazo completo de la membrana (MbsA). , subunidades B, C, D, E, G, H, H 'y M) y la subunidad catalítica clave de la reducción de azufre (MbsL) (Fig. 2a y Datos complementarios 1). En comparación con el MBH bacteriano que produce hidrógeno, el MBS derivado de arqueas permite a las células convertir energía de manera más eficiente con un potencial redox 3,4 veces mayor para reducir el azufre elemental (S0) a sulfuro de hidrógeno (H2S) que el MBH39,40. Además, dos complejos de equilibrio redox en 3DAC, la hidrogenasa I soluble (SH1) y la ferredoxina oxidorreductasa II dependiente de NADP (Nfn2), también son ortólogos de arqueas con una alta identidad (>60%) como genes reportados en arqueas hipertermófilas Thermococcales42,43. .

De acuerdo con el análisis genómico, los experimentos fisiológicos revelaron que la presencia de azufre elemental estimuló significativamente el crecimiento de la cepa 3DAC, en comparación con el medio sin azufre (Fig. 2c, d). Otros sustitutos del azufre, como el sulfato de sodio, el tiosulfato de sodio, la l-cisteína o la l-metionina, no estimularon significativamente el crecimiento (Fig. 2d y Datos complementarios 1). Durante el crecimiento de 3DAC, el azufre elemental se reduce a sulfuro (Fig. 2c). Se propone que MBS lleve a cabo este proceso con la ayuda del equilibrio redox a través de Nfn2 y/o SH1, que también está de acuerdo con el análisis transcriptómico con o sin azufre elemental. Descubrimos que la mayoría de los genes (10 de 13) en MBS estaban significativamente regulados positivamente con azufre elemental en el medio, incluida la subunidad catalítica MbsL. Los genes en Nfn2 también se expresaron altamente con azufre, lo que indica el posible acoplamiento de Nfn2 con MBS para el equilibrio redox. Por el contrario, los genes en MBH y SH1 se redujeron significativamente en presencia de azufre, lo que sugirió competencia entre MBS y MBH y un posible acoplamiento entre MBH y SH1 (Datos complementarios 1).

Además, se construyó un modelo metabólico a escala genómica de 3DAC, GEM-i3DAC (Datos complementarios 1), para simular los impactos de los complejos respiratorios y de equilibrio redox derivados de arqueas (es decir, MBS, SH1 y Nfn2) en 3DAC. El modelo incorporó anotaciones de tuberías automáticas y evidencia bioquímica seleccionada manualmente de (hiper)termófilos de la literatura (Datos complementarios 1). Este modelo fue validado para predecir las tendencias de crecimiento con precisión mediante la utilización de diversas fuentes de carbono y aceptores de electrones en comparación con las observaciones experimentales (Fig. 2b, d). Se realizaron además simulaciones en las eliminaciones 3DAC de tipo salvaje, simples, dobles y triples de los complejos MBS, SH1 y Nfn2 derivados de arqueas. La eliminación de MBS bloqueó el consumo de azufre y la producción de sulfuro de hidrógeno y, en teoría, disminuyó los rendimientos máximos de biomasa al 33% del WT (Fig. 2e y Datos complementarios 1), lo que respaldó la necesidad de MBS de utilizar azufre como aceptor de electrones para estimular el crecimiento de 3DAC. La eliminación única de Nfn2 y SH1 disminuyó el flujo máximo de ATP sintasa al 72% y 50%, respectivamente, lo que indicó la función esencial de Nfn2 y SH1 en la producción de ATP. Estos resultados revelaron la necesidad de estos complejos derivados de arqueas tanto para el crecimiento como para la producción de ATP en la cepa 3DAC. En general, la cepa 3DAC se desempeñó como un heterótrofo termófilo que combina complejos productores de hidrógeno derivados de bacterias y complejos reductores de azufre derivados de arqueas para la respiración. La capacidad de la cepa termófila 3DAC para utilizar la producción de energía derivada de arqueas podría indicar su lugar evolutivo crucial.

El análisis filogenómico basado en diferentes secuencias de proteínas conservadas concatenadas24,44,45,46 y el análisis basado en el gen 16S rRNA ubican la posición filogenética de la cepa 3DAC como un linaje hermano de Coprothermobacterota, un filo bacteriano propuesto por Pavan et al. (2018) 47 (Fig. 3a – c y Fig. complementaria 5a – c). La cepa cultivada de 3DAC más estrechamente relacionada basada en los análisis filogenéticos y filogenómicos del gen 16S rRNA fue Coprothermobacter proteolyticus DSM5265, pero compartía identidades bajas del gen 16S rRNA (81,25–83,00%) y AAI (48–49%) (Datos complementarios 3 y 4 ). C. proteolyticus DSM5265 es un microbio termófilo anaeróbico frecuentemente identificado en sistemas anaeróbicos termófilos artificiales, crece mejor sin cloruro de sodio y es capaz de reducir el tiosulfato a sulfuro31,48,49,50, mientras que 3DAC se aisló del respiradero hidrotermal natural y tiene un preferencia por utilizar aminoácidos y azufre elemental. El análisis filogenético de los genes 16S rRNA muestra que la cepa 3DAC, junto con otros genes 16S rRNA relacionados de cultivos de enriquecimiento de tubos de Alvinella pompejana recolectados de un respiradero de aguas profundas a 13°N en la Dorsal del Pacífico Oriental, forma un grupo monofilético, claramente separándolos de Coprothermobacterota (Figura complementaria 5c). También compilamos secuencias casi completas del gen 16S rRNA (más de 1400 pb,> 95% de cobertura) de Coprothermobacterota y comparamos las identidades de secuencia con las del clado 3DAC. Las identidades de la secuencia del gen 16S rRNA oscilaron entre 75,73 y 83,00% (Datos complementarios 5). Dado que la cepa 3DAC se aisló de un ambiente de respiradero hidrotermal de alta temperatura, proponemos 3DAC como Zhurongbacter thermophilus 3DAC, que lleva el nombre de Zhurong, el dios del fuego en el mito chino. Para una clasificación taxonómica más alta, basada en los rangos AAI sugeridos para el genoma completo51 y la secuencia media del gen 16S rRNA52 para distinguir un nuevo filo, es probable que este linaje represente un filo bacteriano termófilo previamente desconocido. Sin embargo, la puntuación de divergencia evolutiva relativa (RED) de la cepa 3DAC indica que 3DAC podría pertenecer a un linaje de nivel de clase dentro del filo Coprothermobacterota basado en la taxonomía GTDB53. Existe una discordancia entre la clasificación tradicional y GTDB, por lo tanto, aquí solo llamamos temporalmente al clado representado por 3DAC como un linaje de ramificación profunda Zhurongbacterota hasta que se descubran más especies relacionadas con 3DAC para una evaluación taxonómica más precisa, así como la definición taxonómica procariótica. de phylum alcanzan un consenso dentro de la comunidad científica.

un árbol filogenómico de Zhurongbacter thermophilus 3DAC y otras bacterias termófilas importantes que utilizan Archaea como grupo externo con 16 secuencias de proteínas de copia única (CSCP) conservadas con IQ-Tree utilizando el modelo LG + R10 + C60. b Árbol filogenómico de Zhurongbacter thermophilus 3DAC y otras bacterias termófilas importantes utilizando secuencias de proteínas conservadas 16/37/62. El color rojo representa los principales filos de bacterias termófilas, a saber, Zhurongbacterota, Caldisericota, Coprothermobacterota, Dictyoglomota, Thermotogota y Thermodesulfobiota. El color rosa hace referencia a Aquificota, Synergistota y Deinococcota, mientras que el color morado hace referencia a Fusobacteriota. c Inferencias filogenómicas de los linajes del CCTB con 37 secuencias de proteínas conservadas con diferentes modelos pero sin el genoma de Archaea. I-VI representan Thermotogota, Thermodesulfobiota, Dictyoglomota, Caldisericota, Zhurongbacterota y Coprothermobacterota. Las flechas indican otras ramas bacterianas. En todos los árboles, los cuadrados grises indican un bootstrap superior a 0,8.

El análisis filogenético basado en diferentes conjuntos de secuencias de proteínas conservadas concatenadas con diferentes modelos de inferencia reveló que, además de Coprothermobacterota31,47,50, la cepa 3DAC está más estrechamente relacionada con otros grupos de bacterias termófilas, es decir, Caldisericota54,55, Dictyoglomota56, Thermotogota16, 57,58 y termodesulfobiota 44,47,59,60,61,62,63 (Fig. 3a-c). Estos resultados son consistentes con estudios filogenéticos previos que emplearon diferentes productores de proteínas55,64, y todos encontraron que estos linajes bacterianos termófilos se agrupaban. Sin embargo, notamos que el árbol filogenético basado en el gen 16S rRNA coloca varios filos bacterianos no termófilos dentro de un clado, que denominamos "bacterias termófilas estrechamente agrupadas" (CCTB) (Figuras complementarias 5a, b). El conflicto filogenético entre el gen 16S rRNA y las secuencias de proteínas conservadas concatenadas puede ser causado por posibles artefactos filogenéticos que surgen de un sesgo compositivo del gen 16S rRNA, como se ha demostrado en estudios previos65,66,67,68, que pueden no reflejar con precisión la evolución evolutiva. Historia de los linajes termófilos. Por el contrario, las alineaciones concatenadas de múltiples genes marcadores de copia única distribuidos universalmente se han vuelto cada vez más importantes en los análisis evolutivos, ya que proporcionan una mayor resolución y abarcan una porción mayor del genoma que las secuencias marcadoras individuales69.

También probamos sus posiciones filogenéticas con dos conjuntos de datos de enraizamiento de grupos externos, es decir, usando Archaea como grupo externo y usando la posición de la raíz bacteriana propuesta en la ref. 24. Los resultados indican que estos grupos termófilos se agrupan consistentemente cerca de la raíz del árbol filogenómico Archaea-Bacteria, o muestran una monofilia de ramificación profunda con el clado hermano Terrabacteria utilizando los dos métodos de enraizamiento, respectivamente (Fig. 3a, b). Fisiológicamente, todos los linajes bacterianos mencionados anteriormente también comparten capacidades metabólicas similares, por ejemplo, casi todos sus linajes tienen un estilo de vida anaeróbico, son capaces de utilizar azufre elemental o compuestos relacionados con el azufre y son heterótrofos con la capacidad de degradar azúcares y/o proteínas (Datos complementarios 6). Por lo tanto, aquí nos referimos a este clado como "bacterias termófilas estrechamente agrupadas (CCTB)" para describir estos filos de bacterias termófilas que se agrupan estrechamente con 3DAC y se ramifican en árboles filogenómicos bacterianos. La CCTB contiene al menos seis linajes que tienen cepas cultivadas puras: Zhurongbacter, Caldisericota, Coprothermobacterota, Dictyoglomota, Thermotogota y Thermodesulfobiota. Algunos otros filos candidatos, como Deinococcota y Synergistota, también se agrupan con el clado (Fig. 3a) y, por lo tanto, podrían pertenecer al CCTB. Sin embargo, aunque varios de sus miembros también son bacterias termófilas, estos filos han desarrollado múltiples linajes de bacterias no termófilas70,71,72. Además, algunos filos candidatos se agrupan con el CCTB en el árbol del gen 16S rRNA, pero muestran cierta inconsistencia en el árbol filogenómico utilizando diferentes conjuntos de secuencias de proteínas marcadoras conservadas, como la termófila Aquificota. Hemos verificado cuidadosamente la filogenia de Aquificota mediante diferentes métodos y descubrimos que la mayoría de los genes dentro de Aquificota se han sometido a una transferencia genética horizontal (HGT) como se describió anteriormente73,74 (Figuras complementarias 6 y 7), lo que influiría en su inferencia filogenética. En general, en el futuro es necesario resolver más estudios sobre si los filos Deinococcota, Synergistota, Aquificota e incluso otros clados estrechamente relacionados tenían un origen termófilo y se ramificaban como linajes hermanos con CCTB.

Los análisis ancestrales filogenéticos indican que los miembros de la CCTB (Zhurongbacter, Caldisericota, Coprothermobacterota, Dictyoglomota, Thermotogota y Thermodesulfobiota) podrían haber compartido un último ancestro común potencialmente. El conjunto de genes ancestrales predicho de seis linajes, en general, incluye genes que codifican componentes relacionados con la termófila (supuestas proteínas de choque térmico), flagelar que permite su movimiento, hidrogenasa (tipo grupo FeFe), así como vías de utilización de sacáridos y aminoácidos ( ALE predijo el número de copias del gen> 0,3, datos complementarios 2). Sin embargo, las rutas de biosíntesis de aminoácidos no están completas, posiblemente debido a la limitación de la predicción ancestral. Se construyó además un modelo metabólico a escala genómica del ancestro CCTB que sugiere que es una bacteria mixotrófica móvil con dióxido de carbono, sacáridos y proteínas como sustratos (Datos complementarios 2). Este metabolismo ancestral predicho del ancestro CCTB también comparte muchas similitudes con las capacidades metabólicas recientemente inferidas del último ancestro común universal (LUCA) y LBCA20,24,75. El ancestro CCTB, LUCA y LBCA, se consideran microorganismos estrictamente anaeróbicos. Se predice que tanto el ancestro CCTB como LUCA serán termófilos y comparten el potencial de metabolizar el hidrógeno, mientras que LBCA y el ancestro CCTB comparten las predicciones de motilidad y el potencial de degradar compuestos orgánicos de carbono.

Dentro del clado CCTB, después de la diversificación del ancestro CCTB, cada linaje se adaptó a diferentes entornos y evolucionó gradualmente para formar características específicas mediante la ganancia y pérdida de genes (Fig. 4 y Fig. 8 complementaria), especialmente en el metabolismo del azufre y las vías de utilización del carbono. . Para la respiración de azufre, la mayoría de los linajes de CCTB contenían la supuesta subunidad catalítica gen codificante MbsL del grupo de genes codificadores del complejo MBS y/o MBH (Figura complementaria 9)40, que es responsable de los metabolismos del azufre y el hidrógeno. Dado que la capacidad de respiración de azufre estimula fuertemente el crecimiento de 3DAC en el presente estudio y otras cepas en estudios anteriores76, indica que su antepasado podría originarse en un respiradero hidrotermal rico en compuestos de azufre o en un entorno de aguas termales77,78. Para la asimilación de carbono, los miembros de los clados Zhurongbacter, Caldisericota, Coprothermobacterota, Dictyoglomota y Thermotogota se consideran bacterias heterótrofas termófilas, pero diversificaron sus preferencias por la fuente de carbono (Figura 8 complementaria), como la ganancia y pérdida de genes para péptidos y azúcares. genes de transporte y motilidad (Fig. 4).

Ilustración de las características metabólicas del ancestro CCTB y diferentes linajes bacterianos de CCTB (Datos complementarios 6), el respiradero hidrotermal aquí indica que estas bacterias podrían haberse originado en ambientes similares en la Tierra primitiva pero bajo radiación de adaptación durante su historia evolutiva. Pro proteínas, Sac. sacáridos, OC carbono orgánico.

A medida que las tecnologías de cultivo se desarrollen rápidamente, se aislarán y caracterizarán de manera integral más bacterias termófilas de ramificación profunda agrupadas con el CCTB a través de nuestra estrategia de cultivo recientemente diseñada. El descubrimiento de la nueva cepa de bacteria de ramificación profunda 3DAC con la capacidad de utilizar la producción de energía derivada de arqueas puede verse como una pieza del rompecabezas evolutivo termófilo. Con linajes más ramificados por descubrir en el futuro, la historia fisiológica y evolutiva del CCTB nos permitirá ver a través del metabolismo básico y la expansión del nicho de la vida temprana.

La muestra original se recolectó con el vehículo de investigación de aguas profundas (ROV) Jason II operado remotamente durante el crucero de investigación R/V Atlantis AT26-10 (inmersión 761) de una chimenea de humo negro en el respiradero ubicado en el punto profundo 9°N. campo de respiraderos marinos en la subida del Pacífico Oriental (9°46,25' N, 104°16,74' W, profundidad del agua 2528 m). La temperatura del fluido emitido fue de 231 °C. Puede encontrar más información sobre la geoquímica de los fluidos y las comunidades microbianas en las paredes de la chimenea en la ref. 34. Las piezas de la chimenea se almacenaron inmediatamente después de su recuperación en tubos anaeróbicos estériles, y el espacio superior de los tubos se llenó con gas nitrógeno puro con una ligera sobrepresión para evitar la entrada de oxígeno. Luego las muestras se almacenaron a 4 °C hasta su enriquecimiento en el laboratorio.

La capa exterior de la muestra de chimenea negra (0,25 g) se enriqueció primero anaeróbicamente en un medio SME79, que contenía los siguientes componentes (L-1): NaCl, 20,0 g; MgSO4·7 H2O, 3,5 g; MgCl2·6 H2O, 2,75 g; KCl, 0,325 g; KNO3, 2,0 g; EEM, 4,27 g; NaBr, 50,0 mg; H3BO3, 15,0 mg; SrCl2·6 H2O, 7,5 mg; (NH4)2SO4, 10,0 mg; KI, 0,05 mg; Na2WO2·2H2O, 0,1 mg; CaCl2·2H2O, 0,75 g; KH2PO4, 0,5 g; NiCl2·6H2O, 2,0 mg; y resazurina, 1,0 mg. El pH del medio se ajustó a 6,0 usando NaOH 1 M. Después del autoclave, se agregaron al medio (L-1) 1 ml de mezcla de oligoelementos, 1 ml de mezcla de vitaminas, 1 ml de solución de tiamina y 1 ml de solución de vitamina B1280. Luego, se separaron alícuotas de 50 ml del medio en frascos de suero de vidrio de 150 ml y se suplementaron con 0,5 g de azufre elemental y 0,5 ml de Na2S · 9H2O (10 %, p/v; pH 7,0), y se taparon herméticamente los frascos. presurizado con hidrógeno/dióxido de carbono (80: 20; 101 kPa). Los cultivos se incubaron a 50 °C. Obtuvimos el enriquecimiento original en este medio quimiolitotrófico, subcultivamos (1% de inoculación) las células en este medio durante cinco generaciones y luego transferimos el enriquecimiento de la quinta generación (1% de inoculación) a un medio TRM heterótrofo81 con la siguiente composición (L −1): 1 g de extracto de levadura, 4 g de triptona, 23 g de NaCl, 5 g de MgCl2·6H2O, 0,7 g de KCl, 0,5 g de (NH4)2SO4, 3,3 g de sal disódica de PIPES, 1 ml de NaBr (5%, p/v), 1 ml de SrCl2·6H2O (1%, p/v), 1 ml de KH2PO4 (5%, p/v), 1 ml de K2HPO4 (5%, p/v) , 1 ml de CaCl2·2 H2O (2%, p/v) y 1 ml de Na2WO4 (10 mM). El medio se ajustó a pH 7,0, se esterilizó en autoclave, se separó en tubos anaeróbicos (5 ml) y se complementó con 0,05 g de azufre elemental y 0,05 ml de Na2S · 9 H2O (10 %, p/v; pH 7,0), y el espacio de cabeza de los tubos se presurizó con gas nitrógeno puro. El enriquecimiento heterótrofo se realizó a 45 °C. Las colonias se obtuvieron en medio sólido TRM (1,5 % Gelrite) utilizando el método del tubo rodante, que se repitió tres veces.

La tinción fluorescente con SYBR Green I (Invitrogen) se llevó a cabo en células filtradas sobre membranas GTBP de policarbonato de 0,2 μm (Millipore) siguiendo protocolos establecidos82. Las imágenes fueron capturadas con un microscopio de fluorescencia (Nikon Eclipse 90i).

Para la microscopía electrónica de transmisión, las células se recolectaron a 3000 × g durante 5 minutos, se fijaron en formaldehído al 4% durante 2 horas a temperatura ambiente y se lavaron con 1 × PBS (pH 7,4). Las células fijadas se tiñeron negativamente con ácido fosfotúngstico al 2% (p/v) (pH 6,5) para su observación con un microscopio electrónico de transmisión (FEI Tecnai G2 Spirit Biotwin) a un voltaje de aceleración de 120 kV.

Los efectos de la temperatura, el pH y la concentración de NaCl sobre el crecimiento de la cepa 3DAC se determinaron en un medio anaeróbico TRM con un gas de espacio de cabeza compuesto de gas nitrógeno puro a presión atmosférica suplementado con 1% (p/v) de azufre elemental. Para evaluar la temperatura óptima para el crecimiento, la cepa 3DAC se cultivó a 25–80 °C con intervalos de 5 °C. Los rangos de pH y concentraciones de NaCl para el crecimiento se determinaron a 45 °C. El pH óptimo para el crecimiento se determinó variando el pH en el medio de cultivo entre 4,0 y 9,0 utilizando los siguientes tampones a una concentración de 10 mM: acetato a pH 4,0, 4,5 y 5,0; MES a pH 5,5 y 6,0; TUBERÍAS a pH 6,5 y 7,0; HEPES a pH 7,5 y 8,0; y TAPS a pH 8,5 y 9,0. El pH se ajustó a temperatura ambiente antes del tratamiento en autoclave. Para probar el efecto de la concentración de NaCl sobre el crecimiento, se añadió NaCl al medio en concentraciones finales dentro del rango de 0,5 a 5,0 % (p/v). Todas estas pruebas se realizaron por triplicado en la oscuridad y sin agitación. El crecimiento se determinó monitorizando la OD600 con un colorímetro de cuarzo (recorrido óptico de 50 mm) en un espectrofotómetro (HACH DR5000). La tasa de crecimiento específica (μ; h −1) se calculó según la ecuación μ = ln[OD600(t2)/OD600(t1)]/(t2 − t1), donde OD600(t1) y OD600(t2) son las Las densidades ópticas de los cultivos líquidos medidas a 600 nm en los puntos de tiempo t2 y t1, y t1 y t2 son los puntos de tiempo (en horas) de las fases de crecimiento exponencial83. Las tasas de crecimiento se calcularon mediante análisis de regresión lineal de 4 a 6 puntos a lo largo de las porciones lineales de las curvas de crecimiento.

El rango de presión (0,1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100 MPa) se probó con jeringas cargadas con TRM (2,5 % NaCl, pH 7,0) suplementado con 1 % (p/ v) azufre elemental. Estas jeringas se colocaron en reactores de alta presión y alta temperatura y se incubaron a 70 °C. Los rendimientos y las tasas de crecimiento se midieron como se describió anteriormente. Todas estas pruebas se realizaron por triplicado.

Licores madre de 20 tipos de aminoácidos (l-alanina, l-arginina, l-asparagina, ácido l-aspártico, l-cisteína, l-glutamina, ácido l-glutámico, glicina, l-histidina, l-isoleucina, l (leucina, l-lisina, l-metionina, l-fenilalanina, l-prolina, l-serina, l-treonina, l-triptófano, l-tirosina y l-valina). Luego, cada combinación de licores madre de 19 aminoácidos se añadió al medio TRM basal (NaCl al 2,5%, sin extracto de levadura ni triptona, suplementado con 1 ml de solución de oligoelementos84, 10 ml de solución de vitaminas85 y 1% (p/v) de licor elemental. azufre) para mantener cada aminoácido en una concentración final de 0,1 g/L. Se estableció medio TRM basal que contenía los 20 aminoácidos y ningún aminoácido como control positivo y negativo, respectivamente. El pH de todos los medios probados se ajustó a 7,0 a temperatura ambiente. Para todas las pruebas, los cultivos positivos se transfirieron (1% de inóculo) al medio analizado al menos cinco veces para confirmar el crecimiento. Todas las pruebas se realizaron por duplicado a presión atmosférica y con incubación a 70 °C.

Se agregaron varias fuentes de carbono individuales a un medio TRM basal (NaCl al 2,5 %, que contiene solo un 0,002 % de extracto de levadura, sin ninguna otra fuente de carbono orgánico) suplementado con un 1 % (p/v) de azufre elemental. Se probaron las siguientes fuentes individuales de carbono, todas con una concentración final de 0,2 % (p/v): peptona, casaminoácidos, extracto de carne, extracto de levadura, triptona, acetato de sodio, formiato de sodio, citrato de sodio, piruvato de sodio, oxalato de sodio. , d-fructosa, d-(+)-glucosa, d-(+)-xilosa, d-(+)-maltosa, sacarosa, almidón, glucógeno, N-acetil-d-glucosamina, d-manitol, l-alanina , l-arginina, l-asparagina, ácido l-aspártico, l-cisteína, l-glutamina, ácido l-glutámico, glicina, l-histidina, l-isoleucina, l-leucina, l-lisina, l-metionina, l -fenilalanina, l-prolina, l-serina, l-treonina, l-triptófano, l-tirosina y l-valina. El crecimiento se registró después de 24 y 48 h. Se prepararon controles negativos (TRM basal no inoculado) y positivos (TRM inoculado que contiene extracto de levadura y peptona) para cada sustrato. Para todas las pruebas, se transfirieron cultivos positivos (1% de inóculo) al medio probado para confirmar el crecimiento.

Para probar la utilización de la fuente de carbono con la adición de 20 tipos de aminoácidos, se agregaron varias fuentes de carbono en una concentración final del 0,2% (p/v) a un medio TRM basal (NaCl al 2,5%, sin extracto de levadura ni triptona) y se complementaron. con 20 tipos de aminoácidos (cada uno en una concentración final de 0,1 g/L) y 1% (p/v) de azufre elemental. Las fuentes de carbono utilizadas fueron las siguientes: d-(+)-glucosa, d-fructosa, d-(+)-maltosa, sacarosa, almidón, acetato de sodio, formiato de sodio y piruvato de sodio. Como control se utilizó medio TRM basal suplementado con 20 tipos de aminoácidos y 1% (p/v) de azufre elemental.

Para examinar la capacidad del aislado para crecer en ausencia de azufre elemental, las células se cultivaron en medio TRM (NaCl al 2,5%, sin sulfato de sodio) sin azufre. También se probaron otros sustitutos del azufre, como sulfato de sodio (20 mM), sulfito de sodio (20 mM), tiosulfato de sodio (20 mM), l-cisteína (20 mM) y l-metionina (20 mM).

El pH de todos los medios probados se ajustó a 7,0 a temperatura ambiente. Todas las pruebas se realizaron por duplicado a presión atmosférica y con incubación a 70 °C. En cultivos que contenían sustratos insolubles, el crecimiento se controló mediante examen microscópico.

La concentración de sulfuro se midió mediante el método del azul de metileno86 utilizando un kit de medición de sulfuro (HACH) en un espectrofotómetro (HACH DR5000).

El ADN genómico se extrajo mediante un método de extracción de ADN modificado basado en SDS87 y se secuenció en las plataformas de secuenciación PacBio RSII SMRT e Illumina HiSeq X Ten (BGI, China). El genoma se ensambló en un contig a partir de las lecturas de PacBio (3668 Mbp, cobertura de 2308 veces) mediante Falcon v0.3.088 y Celera Assembler v8.389. Luego, el genoma ensamblado se corrigió con datos de Illumina HiSeq (736 Mbp, cobertura de 463 veces) utilizando GATK v1.6–1390. Los genes codificadores de proteínas se predijeron con Glimmer v3.0291, y las anotaciones de ARNr y ARNt se realizaron con RNAmmer v1.292 y tRNAscan-SE v1.3.193, respectivamente. Las funciones genéticas previstas se anotaron con bases de datos que incluyen NCBI-nr (actualizado el 10 de octubre de 2017), KEGG (BlastKOALA, v2.2, actualizado el 15 de mayo de 2019)94 y eggNOG-Mapper v2.0.1b-2-g816e19095. Los valores promedio de identidad de aminoácidos (AAI) se calcularon mediante CompareM v.0.0.23 (https://github.com/dparks1134/CompareM).

Para la muestra de chimenea y el enriquecimiento quimioautótrofo, la región bacteriana V4 del gen 16S rRNA fue amplificada por B515F (5'-XXXXXXXXGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') con etiquetas clave de ocho nucleótidos para cada muestra y B806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 96; la región X representa las diversas etiquetas clave para cada muestra. El programa de PCR fue de 3 min a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 94 °C durante 40 s, 56 °C durante 1 min y 72 °C durante 1 min. El paso de extensión final fue a 72 °C durante 7 min. La mezcla de amplificación de 50 µl contenía 1 µl de cada cebador directo e inverso, 1 µl de ADN molde, 5 µl de tampón ExTaq 10 ×, 0,5 µl de polimerasa ExTaq (TaKaRa, Japón), 4 µl de mezcla de dNTP 2,5 mM y 37,5 µl de agua dd. Los productos de PCR se purificaron con un kit de extracción en gel EZNA (OmegaBio-Tek, EE. UU.) y se secuenciaron en la plataforma MiSeq (Illumina, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El análisis de datos de las secuencias de 16S rRNA MiSeq se realizó utilizando el software QIIME versión 1.9.197 y la versión compatible con QIIME de la base de datos SILVA-132 para la alineación basada en plantillas y la asignación taxonómica. Las lecturas ensambladas que pasaron la verificación de quimera se agruparon en unidades taxonómicas operativas (OTU) de novo con un límite del 97% de similitud de secuencia.

Las células de la cepa 3DAC cultivadas con y sin azufre se recogieron en la fase logarítmica mediante centrifugación. Se prepararon tres réplicas bajo cada condición para el análisis del transcriptoma. El ARN total se extrajo utilizando un kit Total RNA Extractor (TRIzol) (Sangon Biotech, China) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para la preparación de la biblioteca de secuenciación de ARN, se eliminó el ADN genómico con ADNasa I y el ARN ribosómico (ARNr) con un kit de agotamiento de ARNr Ribo-off (bacterias) (Vazyme Biotech Co., Ltd, China). Se generó una biblioteca de ADN complementario (ADNc) mediante un kit de preparación de biblioteca VAHTS™ Stranded mRNA-seq (Vazyme Biotech Co., Ltd, China) siguiendo las instrucciones del fabricante. La secuenciación se realizó en la plataforma Illumina HiSeq 2500 (Illumina, EE. UU.) en Sangon Biotech (Shanghai Co., Ltd., China).

Los controles de calidad de la secuenciación de las lecturas sin procesar producidas por Illumina HiSeq 2500 se evaluaron mediante FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) y todas las muestras pasaron. Las lecturas de baja calidad (valor Q de <20), los nucleótidos "N" ambiguos, las secuencias adaptadoras y los fragmentos de <35 pb se eliminaron de las lecturas sin procesar con Trimmomatic98 para su posterior análisis. El ARNr se eliminó utilizando un sortmerna99 con la configuración predeterminada. La lectura del mapeo del ARN no rRNA en el genoma de Zhurongbacter thermophilus 3DAC se realizó utilizando Bowtie 2100 y se resumió la información de mapeo relevante. Las lecturas asignadas de forma única se recopilaron y analizaron con el paquete DESeq2 basado en la distribución de Poisson para identificar los genes expresados ​​diferencialmente (DEG). La estimación de los niveles de expresión génica se basó en los valores de transcripción por millón (TPM)101.

Para validar los datos de RNA-Seq, se cuantificaron los niveles de expresión de diez genes seleccionados al azar mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Después de la extracción de ARN, el ADN residual se eliminó mediante un kit TURBO DNA-free (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.), y la transcripción inversa de la síntesis de ADNc fue seguida por un kit de síntesis de ADNc RevertAid First Strand (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Los cebadores utilizados para la PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) fueron diseñados por Primer-BLAST102 (//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) y se enumeran en Datos complementarios 7. Gen La expresión se cuantificó en diferentes muestras utilizando el gen 16S rRNA como gen de referencia. La RT-qPCR se realizó en un instrumento de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems, EE. UU.) con PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, EE. UU.) usando el siguiente programa: 95 °C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60 °C durante 1 min. Todos los análisis qRT-PCR se realizaron con cuatro réplicas técnicas. Los cambios en los pliegues de RNA-Seq se representaron frente a los cambios en los pliegues de qRT-PCR y se calcularon los coeficientes de correlación (R2) entre estos dos conjuntos de datos (Figura complementaria 10).

Para el árbol del gen 16S rRNA, las secuencias del gen 16S se alinearon usando SINA v1.2.11103, y la alineación completa se eliminó de las columnas que contenían 70 % o más espacios con un script Perl. IQ-TREE104 v2.0.6 infirió la filogenia de máxima probabilidad del árbol genético del ARNr 16S con las opciones “-MFP -B 1000” para la selección del modelo de mejor ajuste y arranque ultrarrápido. Las secuencias de referencia de otras bacterias se descargaron de la base de datos Silva, las secuencias de menos de 1400 pb se filtraron y las OTU se seleccionaron de las secuencias restantes con un límite del 97%. Para el árbol se utilizaron las secuencias OTU representativas descritas anteriormente.

Para el análisis filogenómico basado en proteínas conservadas, el conjunto de datos bacterianos representativos utilizado por Coleman et al.24 y los genomas de referencia de arqueas seleccionados de los diferentes filos se descargaron de la base de datos de genoma procariótico del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih. gobierno/asamblea/). Estos genomas de referencia y el genoma 3DAC de este estudio se utilizaron para construir un árbol filogenómico basado en una alineación concatenada de tres conjuntos diferentes de genes marcadores (Datos complementarios 8-10)24,45,46. Específicamente, cada una de las secuencias de proteínas marcadoras de los genomas de referencia y el genoma 3DAC se alineó utilizando el algoritmo MAFFT v7.313105 con los parámetros --ep 0 --genafpair --maxiterate 1000 y se filtró con trimAl v1.4.rev2106 con el parámetro -automatizado1. Luego, todas las secuencias de proteínas marcadoras se concatenaron en una única alineación y se construyeron árboles filogenéticos utilizando IQ-Tree104 v2.0.6 con el modelo LG + C60 + R10 de mejor ajuste con un valor de arranque ultrarrápido de 1000.

Para ilustrar la afiliación filogenética del filo Aquificota, se descargaron genomas de referencia de la base de datos del NCBI y se descargaron de 5 a 10 genomas para cada filo de acuerdo con la taxonomía del NCBI. Luego, cada una de las 37 secuencias de proteínas marcadoras de los genomas de referencia se extrajo y alineó utilizando el algoritmo MAFFT v7.313 con los parámetros --ep 0 --genafpair --maxiterate 1000 y se filtró con trimAl v1.4.rev2 con el parámetro - automatizado1. Luego, se usaron por separado 37 secuencias de proteínas marcadoras para construir árboles filogenéticos usando IQ-Tree v2.0.6 con el modelo LG + C60 + F + G con un valor de arranque ultrarrápido de 1000 para evaluar los posibles eventos HGT.

Para el análisis filogenético de la proteína MbsL, sus secuencias se extrajeron de los genomas de referencia de Caldisericota, Thermotogota, Thermodesulfobiota, Aquificota, Zhrongbacter y Thermococcales. Estas secuencias con referencias luego se alinearon usando el algoritmo MAFFT v7.313 con los parámetros --ep 0 --genafpair --maxiterate 1000 y se filtraron con trimAl v1.4.rev2 con el parámetro -automated1. Después de eso, el árbol filogenético se construyó utilizando IQ-Tree v2.0.6 mediante el modelo que mejor se ajusta con un valor de arranque ultrarrápido de 1000. Todos los árboles se visualizaron mediante el software en línea iTOL107.

Se seleccionaron un total de 43 genomas completos bacterianos cultivados (Datos complementarios 11) de la CCTB, así como posibles filos candidatos para análisis evolutivos. Los genomas se descargaron de la base de datos genómica NCBI y se predijeron con Prodigal versión 2.6.3108. Luego, todos los genomas se anotaron con eggNOG-Mapper v2.0.1b-2-g816e19095. El análisis genómico comparativo fue realizado por OrthoFinder109 con parámetros predeterminados. Se obtuvo un total de 6.578 ortogrupos de 43 genomas representativos de OrthoFinder109. Los ortogrupos que contienen cuatro o más secuencias se alinearon por separado utilizando el algoritmo MAFFT v7.313105 con los parámetros --ep 0 --genafpair --maxiterate 1000, se filtraron con trimAl v1.4.rev2106 con el parámetro -automated1 y luego se construido utilizando IQ-Tree con el modelo que mejor se ajusta. Para abordar la historia evolutiva de la CCTB, se infirieron conjuntos de genes de familias ancestrales utilizando el programa de estimación de probabilidad fusionada (ALE) versión 0.4110. En el presente estudio solo se consideraron bacterias con información genómica completa porque los genomas incompletos conducirían a análisis sesgados en los procesos de ganancia y pérdida de genes. Aquí, los filos Synergistota y Deinococcota se utilizaron como grupos externos. En el análisis ALE también se consideraron los genomas representativos de los filos Aquificota, Thermosulfidibacterota y Thermodesulfobacteriota. Para la CCTB, las bacterias cultivadas con genomas completos en el filo Dictyoglomota incluyen Dictyoglomus turgidum DSM6724 y Dictyoglomus thermophilum H-6-12; el filo Thermodesulfobiota incluye Thermodesulfobium acidiphilum 3127-1 GCA y Thermodesulfobium narugense DSM14796; el filo Caldisericota incluye Caldisericum exile AZM16c01; el filo Zhurongbacter incluye Zhurongbacter thermophilus 3DAC; el filo Coprothermobacterota incluye Coprothermobacter platensis DSM11748 y Coprothermobacter proteolyticus DSM5265; y el filo Thermotogota incluye Pseudothermotoga hipogea DSM11164, Thermotoga neapolitana DSM4359, Thermosipho melanesiensis BI429, Fervidobacterium pennivorans DSM9078, Kosmotoga pacifica SLHLJ1, Mesotoga prima MesG1Ag42, Defluviitoga tunisiensis L3, Petrotoga mobilis SJ95, Marinitoga piezophila KA3 y Athalassotoga saccharophila NAS-01. La reconstrucción metabólica de los antepasados ​​se realizó con el conjunto de genes ancestrales predicho (851 secuencias) en el nodo del CCTB con un número promedio de copias de genes superior a 0,3.

Se construyó un modelo metabólico a escala genómica de Zhurongbacter thermophilus 3DAC, GEM-i3DAC, de acuerdo con el genoma completo de la cepa 3DAC. El borrador de la construcción del modelo hacía referencia al mapeo de ortólogos en bases de datos públicas (KEGG111, EggNOG95, BIGG112,113, ModelSeed114 y TCDB115) (realizado en noviembre de 2020) y el modelo publicado de la cepa bacteriana termófila relacionada Thermotoga maritima MSB8116,117. Se llevaron a cabo extensas curaciones manuales después de la reconstrucción del modelo preliminar para integrar la evidencia bioquímica más reciente de funciones enzimáticas en (hiper)termófilos. En general, la evidencia bibliográfica se asignó a 57 reacciones en el modelo 3DAC. Las ecuaciones de biomasa de 3DAC se formularon basándose en la biosíntesis de macromoléculas, incluidos ADN, ARN y proteínas. Su biosíntesis se definió para tener en cuenta la composición en milimoles de cada bloque de construcción al ensamblar un gramo de un componente determinado y el costo energético asociado. Se formularon simulaciones de utilización de fuentes de carbono, aceptores de electrones y eliminación de genes con restricciones de intercambio que representan las condiciones de cultivo correspondientes utilizadas en los experimentos.

Los términos KO del conjunto de genes ancestrales predichos se utilizaron para construir el modelo metabólico inicial a escala genómica del último ancestro común del CCTB. Las reacciones para cada término KO se obtuvieron de la última base de datos KEGG (realizada en marzo de 2022). Los compuestos se introdujeron inicialmente a partir de la última base de datos KEGG, pero se agregaron las cargas fisiológicas de cada uno y el número de hidrógeno modificado de los compuestos cargados. La función objetivo de la biomasa se introdujo a partir del modelo central de Escherichia coli118, incluido el ADN, el ARN y las proteínas que representaron ~80% del peso seco de las células119 (Datos complementarios 2). Se realizaron simulaciones metabólicas con restricciones de intercambio identificadas en función de los parámetros ambientales medidos en respiraderos hidrotermales típicos120 y los nutrientes y productos potenciales revelados por la reconstrucción metabólica (Datos complementarios 2). El conocimiento actual de las vías de síntesis de aminoácidos en bacterias y arqueas basado en la anotación genética es inadecuado, y los aminoácidos que faltan o están incompletos en la vía de síntesis también pueden no ser esenciales121,122. 3DAC tiene características metabólicas muy similares a Thermococcus y, según nuestros resultados previos de pruebas de aminoácidos esenciales para Thermococcus eurythermalis A501 y la presencia/ausencia de sus enzimas clave en el genoma completo123, hemos delineado un criterio para determinar los aminoácidos esenciales en el nivel genómico, intentando reducir el sesgo provocado por esta brecha de conocimiento. Los aminoácidos esenciales se identificaron como aquellos que faltan en el 50% o más de las reacciones de toda la ruta de biosíntesis. Otros aminoácidos fueron tratados como no esenciales. Para simular cuantitativamente los rendimientos del crecimiento utilizando las únicas fuentes de carbono probadas, cada fuente de carbono se limitó a 10 mM de carbono total para evitar la influencia de diferentes números de carbono en la fórmula, con todos los aminoácidos esenciales (1 mM para cada uno).

Tanto para el modelo 3DAC como para el modelo ancestro, se realizaron comprobaciones de coherencia de todas las reacciones computacionalmente utilizando las funciones formulacheck, chargecheck y masscheck en PSAMM versión 1.1.1 (https://zhanglab.github.io/psamm/)124, y el Las ecuaciones desequilibradas se seleccionaron manualmente. Se realizaron procesos de llenado de huecos para completar la síntesis de los principales componentes de la biomasa (ADN, ARN y proteínas) y cofactores esenciales (es decir, NAD+/NADP+ y CoA) mediante la función fastgapfill en PSAMM. El análisis de variación de flujo (FVA) para optimizar la producción de biomasa se realizó utilizando la función fva en PSAMM con IBM ILOG CPLEX Optimizer versión 12.7.1.0.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

La secuencia del genoma de Zhurongbacter thermophilus 3DAC se reconstruyó y se depositó con el número de acceso CP046447. Los datos de secuenciación de amplicones se han depositado en la SRA con los números de acceso SRR14072822, SRR14072823, SRR14072817, SRR14072825, SRR14072824, SRR14072798 y SRR14072797, y los datos de secuencia del transcriptoma se han depositado en la SRA con los números de acceso SRR14072890. y SRR14072891. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a todos los miembros de la tripulación del R/V Atlantis y del ROV Jason II durante el crucero AT26-10 por su esfuerzo y ayuda en la recolección de muestras. Agradecemos a la Dra. Fengping Wang por sus útiles debates sobre diseño experimental y redacción de artículos. También agradecemos al Dr. Tom A. Williams y Edmund Moody por su amable ayuda y discusión sobre los análisis filogenéticos. Este estudio fue financiado por los siguientes fondos: la Fundación de Ciencias Naturales de China (números de subvención 41921006, 41776173, 92051116, 91951209, 20ZR1428000, 42106087), el proyecto nacional clave de I+D de China (número de subvención 2018YFC0309800), así como los EE. UU. La Fundación Nacional de Ciencias subvenciona OCE-1136727 y el Fondo de Inversión en Ciencia de WHOI a SMS

Estos autores contribuyeron igualmente: Hao Leng, Yinzhao Wang.

Laboratorio Estatal Clave de Metabolismo Microbiano, Facultad de Ciencias de la Vida y Biotecnología, Universidad Jiao Tong de Shanghai, Shanghai, China

Hao Leng, Yinzhao Wang, Weishu Zhao y Xiang Xiao

Centro Internacional para la Investigación de la Vida Profunda (IC-DLI), Universidad Jiao Tong de Shanghai, Shanghai, China

Hao Leng, Yinzhao Wang, Weishu Zhao y Xiang Xiao

Departamento de Biología, Institución Oceanográfica Woods Hole, Woods Hole, MA, EE. UU.

Stefan Sievert

Laboratorio de Ingeniería y Ciencias Marinas del Sur de Guangdong (Zhuhai), Zhuhai, Guangdong, China

xiang xiao

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XX diseñó y supervisó el proyecto. XX y SMS recogieron las muestras de chimeneas. HL llevó a cabo los experimentos. YW realizó los análisis filogenéticos y evolutivos con aportes de HLWZ, seleccionó las anotaciones del genoma y realizó las construcciones y simulaciones del modelo metabólico. YW, HL y WZ analizaron los datos. YW, HL, WZ y XX escribieron el manuscrito. SMS revisó el manuscrito. Todos los autores contribuyeron a la versión final del manuscrito y aprobaron el manuscrito y la información de respaldo.

Correspondencia a Xiang Xiao.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Leng, H., Wang, Y., Zhao, W. et al. La identificación de un clado termófilo de ramificación profunda arroja luz sobre la evolución bacteriana temprana. Nat Comuna 14, 4354 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39960-x

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Recibido: 25 de octubre de 2022

Aceptado: 06 de julio de 2023

Publicado: 19 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39960-x

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