Base estructural de la síntesis de peptidoglicano por E. coli RodA

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 5151 (2023) Citar este artículo

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El peptidoglicano (PG) es un componente estructural esencial de la pared celular bacteriana que se sintetiza durante la división y elongación celular. El PG forma un polímero extracelular crucial para la viabilidad celular, cuya síntesis es el objetivo de muchos antibióticos. El ensamblaje de PG requiere una glicosiltransferasa (GT) para generar un polímero de glicano usando un sustrato de Lípido II, que luego se reticula con el PG existente mediante una reacción de transpeptidasa (TP). Una enzima GT de forma, alargamiento, división y esporulación (SEDS) y una proteína de unión a penicilina (PBP) de clase B forman el núcleo del complejo multiproteico necesario para el ensamblaje de PG. Aquí utilizamos microscopía crioelectrónica de partícula única para determinar la estructura de un complejo E. coli RodA-PBP2 específico de elongación celular. Combinamos esta información con análisis bioquímicos, genéticos, espectroscópicos y computacionales para identificar los sitios de unión del lípido II y proponer un mecanismo para la polimerización del lípido II. Nuestros datos sugieren una hipótesis para el movimiento de la cadena de glicano desde el sitio de polimerización del lípido II de RodA hacia el sitio TP de PBP2, uniendo funcionalmente estas dos actividades enzimáticas centrales requeridas para la biosíntesis de peptidoglicano de la pared celular.

La forma de las células en las bacterias está determinada y mantenida por el polímero extracelular peptidoglicano (PG), un sáculo en forma de malla que rodea la membrana citoplasmática y compuesto por cadenas de glicano polimerizadas entrecruzadas por péptidos cortos1. La síntesis de PG limita la velocidad del crecimiento bacteriano y su alteración da como resultado la lisis celular o el cese del crecimiento, como lo aprovechan muchos productos naturales y antibióticos semisintéticos2,3,4,5. Entre ellos se incluyen los β-lactámicos, los antibióticos clínicamente más exitosos hasta la fecha6,7. Las proteínas citoplasmáticas que sintetizan el precursor de PG, el lípido II, un disacárido de N-acetilglucosamina (GlcNAc) y pentapéptido de ácido N-acetilmurámico (MurNAc) unido a pirofosfato de undecaprenilo (C55) (Und-PP), y las proteínas extracelulares responsables de y la posterior polimerización del PG, han sido caracterizados individualmente, bioquímica y estructuralmente8,9.

En el periplasma, la biosíntesis de PG comienza con una glicosiltransferasa (GT) específica del lípido II que forma un polímero de cadena de glicano uniendo los disacáridos de dos moléculas de lípido II, una denominada donante y la otra aceptora, y liberando así Und-PP de el sitio donante (Fig. 1a). Después de que las dos moléculas iniciales de Lípido II se hayan unido, el tetradisacárido resultante unido a Und-PP, denominado Lípido IV, se convierte en el donante de otro aceptor de Lípido II, uniendo a su vez su tetrasacárido al disacárido de Lípido II. para producir el lípido VI. Este ciclo se repite de manera procesiva creando cadenas de polisacáridos progresivamente más largas unidas a Und-PP (el número romano indica el número de grupos monosacáridos en la cadena de polisacárido). Una vez que el polímero de glicano en crecimiento alcanza una longitud suficiente, se une al sáculo de PG existente mediante enlaces cruzados peptídicos entre el pentapéptido de la cadena de glicano y un tallo peptídico en el sáculo de PG existente mediante una transpeptidasa (TP) para producir PG reticulado (Fig. 1a). En E. coli, la GT RodA de la familia de forma, alargamiento, división y esporulación (SEDS) y la PBP2, la proteína monofuncional de unión a penicilina TP clase B, median en estas respectivas tareas enzimáticas10. RodA es una proteína de membrana integral que consta de diez hélices transmembrana (TM)11, mientras que PBP2 tiene una única hélice TM y un dominio extracelular con un pliegue PBP de clase B clásico que contiene el sitio activo TP12,13. Juntos, forman el núcleo del elongasoma14, el complejo responsable de la determinación de la forma del bastón bacteriano. A pesar de los recientes avances en nuestra comprensión de esta máquina molecular15,16, en particular la derivada de la estructura cristalina de un complejo Thermus thermophilus RodA-PBP217, las cuestiones mecanicistas fundamentales siguen sin resolverse. Estos incluyen la caracterización de determinantes moleculares y estados conformacionales necesarios para i) la unión del lípido II, ii) la polimerización GT de cadenas de glicano y iii) la translocación posterior del polímero de glicano al sitio activo TP.

a Arriba, representación esquemática de la reacción catalizada por RodA (verde) y PBP2 (azul). A continuación, la representación química de la síntesis de peptidoglicano con los componentes básicos del Lípido II y los componentes químicos del Lípido II se muestran en un cuadro en la parte superior izquierda. b Mapa de densidad Cryo-EM del complejo RodA-PBP2. La densidad correspondiente a RodA y PBP2 se muestra en verde y azul, respectivamente. c Estructura del complejo RodA-PBP2 mostrada como una cinta con RodA en verde y PBP2 en azul. Los límites aproximados de la membrana se representan como líneas de puntos. d Diagrama esquemático que muestra la topología de RodA coloreada en el arco iris desde el extremo C (azul) hasta el extremo N (rojo), que consta de diez hélices TM y una región periplásmica bien ordenada entre las hélices 7 y 8 de TM. e Se muestra la estructura de RodA girada 90° , con las diez hélices TM coloreadas como en e. Los límites aproximados de la membrana se muestran nuevamente como líneas de puntos.

Aquí, utilizamos microscopía crioelectrónica de una sola partícula (crio-EM) para determinar la estructura del complejo RodA-PBP2 de E. coli, expresado como una fusión funcional y reconstituido en nanodiscos llenos de lípidos, con una resolución de 3,0 Å. Utilizamos un enfoque integrado (que combina información estructural con ensayos bioquímicos y genéticos, simulaciones de dinámica molecular (MD) y experimentos de resonancia doble electrón-electrón (DEER) con etiquetado de espín dirigido al sitio (SDSL) para investigar los determinantes moleculares de la unión de sustratos y la catálisis. y cambios conformacionales necesarios para que esta maquinaria procesiva funcione. Nuestros estudios sugieren un mecanismo que facilitaría la migración de un polímero de glicano en crecimiento hacia el sitio TP de PBP2, permitiendo la reticulación dependiente de TP para formar la capa de PG.

Aunque la mayoría de las bacterias contienen marcos de lectura abiertos (ORF) separados que codifican las actividades GT (SEDS) y TP (PBP), existen ejemplos de un único ORF que codifica una fusión SEDS-PBP18. Anteriormente demostramos que una construcción sintética que consiste en una proteína SEDS fusionada con su PBP afín complementa funcionalmente las eliminaciones genéticas de ambas enzimas13. Razonamos que una fusión SEDS-PBP sería bioquímicamente más manejable que los componentes individuales, y que su estructura en un ambiente lipídico facilitaría en gran medida una comprensión mecanicista del complejo general. Examinamos 189 ortólogos de SEDS para determinar su expresión y estabilidad en detergentes para identificar aquellos susceptibles de estudios estructurales19. A partir de esta selección inicial, se seleccionaron proteínas SEDS de cinco especies diferentes con los niveles de expresión y estabilidad más altos para diseñar un conjunto de fusiones con una o más PBP de especies coincidentes, lo que dio como resultado ocho construcciones únicas (Tabla complementaria 1). Estos se evaluaron nuevamente para determinar su expresión y estabilidad en detergente después de la cromatografía de afinidad por metales (usando una etiqueta de polihistidina codificada genéticamente) y la monodispersidad evaluada mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Según estos criterios, una construcción de fusión entre E. coli RodA y PBP2 (Figura complementaria 1a) tenía el perfil más prometedor para la determinación de la estructura.

A continuación, confirmamos que esta fusión RodA-PBP2 de E. coli tiene actividad GT, que no es inhibida por la moenomicina, a diferencia de las PBP bifuncionales de clase A, como se observa mediante la polimerización del Lípido II modificado con un grupo dansilo fluorescente (dansil lisina Lípido II ; Figura complementaria 1b, c, e). El dominio TP se une (y es modificado covalentemente por) una bocilina fluorescente que imita la penicilina20, figura complementaria 1d, f), lo que sugiere que el dominio TP está intacto. Purificamos la proteína de fusión RodA-PBP2 y, como controles, RodA solo (que termina en el residuo 373 de RodA) y una fusión de RodA con solo la única hélice TM de PBP2 (que termina en el residuo 47 de PBP2) en detergente (Figura complementaria 1g). ). Se analizó la actividad de polimerización del lípido II de estas proteínas (Figura complementaria 1h). RodA de forma aislada tiene actividad GT residual, pero es estimulada significativamente por la presencia de la hélice transmembrana de PBP2 tanto en la fusión de longitud completa como en la versión truncada. Estos resultados son consistentes con lo demostrado previamente para las proteínas de T. thermophilus17.

La fusión RodA-PBP2 se purificó hasta homogeneidad en detergente mediante cromatografía de afinidad por metales seguida de SEC, y luego se reconstituyó en nanodiscos llenos de lípidos (Figura complementaria 1i-l) para su posterior vitrificación y análisis crio-EM. Esto resultó en dos mapas refinados localmente alrededor de la TM y las regiones periplásmicas, ambos con una resolución de 3,0 Å (Fig. 1b, Tabla complementaria 2 y Fig. 2 complementaria). En el mapa TM, pudimos construir de manera confiable la estructura RodA, asignando la secuencia de los residuos 9 a 93 y 109 a 364, así como la hélice TM única de PBP2 adyacente del residuo 10 al 40 (Figura complementaria 3). La estructura muestra diez hélices RodA TM, con extremos N y C intracelulares. Las hélices TM 1-6 y las hélices TM 8-10 forman un haz helicoidal apretado, con la hélice TM 7 extendiéndose alejándose de él, estabilizada por tres hélices yuxtamembrana periplásmica (PH1, PH2 y PH3) (Fig. 1d, e). Además, la hélice TM única PBP2 se ordena y se empaqueta contra las hélices 8 y 9 de RodA TM (Fig. 1c).

El dominio soluble de PBP2 está menos resuelto, pero utilizando Namdinator21 y su estructura cristalina publicada previamente como modelo de entrada22, pudimos construir los residuos 10–343, 401–430, 457–540 y 569–612. No pudimos observar una densidad interpretable para los residuos 344–400 y 431–456 en la punta de PBP2, proximal al sitio activo de TP (Figura complementaria 4a). El sitio de unión para MreC23, una proteína de andamiaje que se une a PBP2 y se cree que afecta su actividad23,24, también conocido como dominio principal, tiene la resolución local más baja en el mapa (Figura complementaria 4b). Sin embargo, la resolución fue suficiente para ajustar las hélices en el dominio de la cabeza al mapa de densidad, a pesar de que observamos cambios estructurales sustanciales en comparación con la estructura cristalina de rayos X publicada anteriormente de PBP2 de E. coli22 (Figura complementaria 4a). .

Al comparar el modelo de T. thermophilus17 con nuestro modelo, observamos que la estructura general de la región TM es muy similar entre los dos, a pesar de tener una identidad de secuencia de solo el 39% (Figura complementaria 4c). Esto incluye el posicionamiento de la hélice 7 de TM, que en ambos se extiende de manera similar desde el núcleo de TM helicoidal. Por el contrario, en el dominio periplásmico de PBP, observamos diferencias estructurales bastante sustanciales. Hay tanto un giro relativo como una inclinación entre los dos, y un cierre de la cabeza y el dominio de anclaje en nuestra estructura en lugar de una apertura en el modelo de T. thermophilus (Figura complementaria 4c).

La síntesis del polímero de glicano requiere un sitio de unión aceptor y donante en RodA, ambos inicialmente acomodan el lípido II. Los dos sustratos iniciales del Lípido II se unen mediante una reacción GT, acoplando el azúcar MurNAc del Lípido II en el sitio donante a la GlcNAc del Lípido II en el sitio aceptor, con Und-PP como producto en el sitio donante (Fig. .1a). Dado que RodA es una enzima procesiva, el Lípido IV (Lípido II polimerizado después de la primera reacción) ahora se convierte en el donante, de modo que la MurNAc unida directamente a Und-PP en el Lípido IV puede transferirse a un aceptor de Lípido II entrante. Para que esto ocurra, el lípido IV necesita pasar del sitio aceptor al donante. Este movimiento de la cadena de glucano en crecimiento desde el sitio aceptor hasta el sitio donante es procesivo, lo que permite que el ciclo se repita produciendo cadenas progresivamente más largas (es decir, lípido VI, lípido VIII, etc.).

El análisis de la porción RodA de la estructura para los supuestos sitios de unión al sustrato revela dos cavidades principales (denominadas cavidades A y B) (Fig. 2a). La cavidad A está situada entre las hélices 6, 7 y 9 de TM, y está enmarcada por un lado por PH1 y por el otro por las hélices 5 y 6 de TM y el bucle periplásmico (PL3) que conecta ambas. El borde de la cavidad A está revestido con residuos conservados (Fig. 2a) y en general es de naturaleza polar (Fig. complementaria 4d). Se extiende hacia la membrana, donde queda expuesta a la bicapa lipídica y está revestida con residuos hidrofóbicos (Fig. 2a y Fig. Suplementaria 4d). La cavidad B está ubicada en el lado opuesto de la varilla A en relación con la cavidad A, entre las hélices 2, 3, 4 y 10 de TM y también está expuesta a la membrana (Fig. 2a). Los residuos que recubren la cavidad B están menos conservados, pero en cuanto a la cavidad A, observamos varios residuos cargados positivamente en su lado periplásmico (Fig. 2a y Fig. Suplementaria 4d). La región que conecta las dos cavidades tiene uno de los grados de conservación más altos de toda la estructura (Fig. 2a, b). Dada su orientación con respecto al sitio TP de PBP2, sugerimos que las cavidades A y B sean los sitios donantes y aceptores de los dos sustratos, respectivamente24.

a Análisis de cavidad de la estructura RodA-PBP2 con RodA-PBP2 mostrada como una superficie coloreada por conservación en una escala de verde (sin conservación) a púrpura (conservación absoluta). Las cavidades se muestran como una superficie semitransparente en naranja. Los volúmenes se calcularon utilizando el servidor Voss Volume Voxelator (3 V)52 utilizando sondas con radios de 10 y 2 Å, correspondientes a la sonda exterior e interior, respectivamente. b Estructura de la región transmembrana de RodA-PBP2 que se muestra como una cinta con los residuos de interés mostrados como palos y las cavidades como en a. Recortes de gráficos de Weblogo58, como en la figura complementaria 6, que se muestran para las regiones de interés. c Gráfico de densidad del lípido II de 50 repeticiones de 10 μs en simulaciones CG MD imparciales del complejo RodA-PBP2. El gráfico muestra dos sitios de unión preferidos del lípido II que se superponen con la cavidad A y la cavidad B. d Comparación de la densidad similar a lípidos (izquierda) observada en la cavidad A en el mapa crio-EM (solo la región del mapa correspondiente a la densidad similar a lípidos) se muestra la densidad) con densidad promedio (derecha) de Und-PP de una simulación MD atomística imparcial de RodA-PBP2 con Und-PP inicialmente acoplado en la cavidad A. e Análisis funcional de la actividad de RodA-PBP2 GT utilizando un ensayo de polimerización de lípidos II in vitro donde el efecto de diferentes residuos se estudió mediante la introducción de mutaciones puntuales y pruebas de actividad. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para probar esta hipótesis, realizamos 50 repeticiones de simulaciones MD de grano grueso (CG) imparciales de 10 μs para identificar la ubicación y las interacciones que tienen los dos sustratos del Lípido II con la superficie de RodA. El análisis de estas simulaciones identificó dos sitios de unión preferidos para el lípido II que se asignan directamente a las cavidades A y B (Fig. 2c). De los dos sitios de unión, la cavidad B parece tener una mayor densidad de partículas para el lípido II que la cavidad A durante el tiempo total de simulación. Esto es consistente con que la cavidad B sea el sitio aceptor, reclutando continuamente lípido II de la membrana. El análisis de densidad también reveló más sitios de interacción, pero cuando se evaluó con PyLipID25, la cavidad B, seguida de la cavidad A, tuvo las mayores ocupaciones de Lipid II durante las simulaciones (Figuras complementarias 5a-d). Específicamente, en las simulaciones de CG, Arg48 y Arg109 (cavidad B) y Arg210 (cavidad A) mostraron la mayor ocupación de interacciones con el lípido II (Figura complementaria 5b). En todos los casos, las interacciones proteína-lípido II predominantes fueron con el grupo principal de peptidoglicano-pirofosfato, mientras que la cola de lípidos interactuó tanto con la proteína como con la membrana lipídica circundante. Combinamos estos datos con el acoplamiento de ligandos para refinar nuestro modelo de cómo el lípido II se une a las cavidades A y B (Figuras complementarias 5e-f).

De acuerdo con nuestras simulaciones, observamos una densidad alargada en el mapa crio-EM dentro de la cavidad A (Fig. 2d). La forma de la densidad es consistente con Und-PP, un producto obligado de cada reacción GT (Fig. 1a). Para profundizar más en esta observación, realizamos tres repeticiones de simulaciones MD atomísticas de 1 μs de RodA-PBP2 insertadas en una membrana de fosfolípidos con Und-PP acoplado en la cavidad A (Figura complementaria 5g). Durante estos experimentos, observamos que Und-PP permaneció estrechamente asociado dentro de esta cavidad y que su ocupación promedio se superpuso con la densidad presente en los datos crio-EM (Fig. 2d).

Ambas cavidades tienen residuos cargados positivamente en su lado periplásmico (Arg210 en la cavidad A; Arg48 y Arg109 en la cavidad B) (Fig. 2b y Fig. Suplementaria 6). Nuestras simulaciones sugieren que estos residuos interactúan con el grupo pirofosfato del Lípido II. Un equivalente de Arg210 en PH1 parece ser parte de un elemento estructural común para las glicosiltransferasas GT-C que utilizan Und-PP como portador, como por ejemplo la ligasa del antígeno O WaaL26,27. Para probar si Arg210 es esencial para la función, lo mutamos a alanina y descubrimos que la actividad de GT in vitro se redujo significativamente (Fig. 2e y Fig. 7a complementaria). También examinamos el fenotipo de una mutación en la arginina correspondiente en B. subtilis mediante un ensayo de esporulación in vivo13. Aquí, la resistencia al calor de las esporas depende de la función del homólogo de RodA SpoVE (Figura complementaria 8) que sintetiza las esporas PG. Observamos que la mutación de SpoVE Arg212 (correspondiente a E. coli RodA Arg210) a alanina tuvo un efecto grave sobre la esporulación (Tabla complementaria 3). Este resultado es consistente con el requisito de esta arginina para la actividad GT (Fig. 2e). Arg48 y Arg109 apuntan hacia la cavidad B (Fig. 2b). La actividad de GT se reduce gravemente in vitro e in vivo cuando Arg48 se muta a alanina (Fig. 2e, Fig. 7a complementaria y Tabla 3), mientras que solo se ve moderadamente afectada in vitro para un mutante Arg109Ala. Estos resultados son consistentes con un papel importante de Arg48 y, en menor medida, Arg109, en la coordinación del pirofosfato del lípido II dentro o al entrar en la cavidad B.

El bucle periplásmico de veinte aminoácidos que conecta las hélices 3 y 4 de TM (PL2) está ubicado adyacente a la cavidad B y potencialmente podría llegar de una cavidad a la otra e interactuar con los sustratos en ambas cavidades, y/o desempeñar un papel en su transición de el aceptor a los sitios donantes. Este bucle es intrínsecamente flexible, como se observa en nuestras simulaciones de MD (Figura complementaria 5b), y solo pudimos asignar parcialmente la secuencia a la densidad en esta región del mapa crio-EM. PL2 tiene varios residuos altamente conservados, incluidos Trp102 y Gln111, que son invariantes en todas las especies analizadas (Figura complementaria 6). PL2 también contiene dos residuos cargados positivamente, Lys97 y Arg101, que aunque sólo se conservan moderadamente, están en una posición adecuada para interactuar con el lípido II. Para probar la función de PL2, mutamos estos dos residuos cargados a alanina. Solo Arg101, que es el más conservado de los dos, mostró una reducción significativa en la actividad en comparación con el tipo salvaje (Fig. 2e y Fig. complementaria 7a). A continuación, mutamos Trp102 o Gln111 a alanina y demostramos que ambos mutantes tenían una actividad GT reducida (Fig. 2e y Fig. 7a complementaria). Sin embargo, la actividad GT de Trp102 parecía mantenerse con una mutación en fenilalanina. La mutación del equivalente Trp104 en B. subtilis SpoVE a alanina o fenilalanina afectó gravemente el fenotipo de esporulación (Tabla complementaria 3), lo que coincide con la importancia funcional de este residuo.

Finalmente, investigamos las funciones potenciales de otros residuos altamente conservados ubicados en o entre las dos cavidades (Glu114, Lys117, Asp159 y Ser344) (Fig. 2b). La actividad de GT en nuestro ensayo de GT in vitro no se vio afectada cuando Ser344 se mutó a alanina, mientras que observamos una reducción en la actividad cuando Asp159 se mutó a valina, lo que coincide con el efecto grave de una mutación de B. subtilis SpoVE Asp163 (el equivalente de E. . coli Asp159) a valina en nuestro ensayo de esporulación in vivo (Tabla complementaria 3). Finalmente, mientras que las mutaciones de Glu114 a alanina y de Lys117 a asparagina tuvieron solo un impacto modesto en la actividad de GT in vitro (Fig. 2e y Fig. 7a complementaria), mutaciones idénticas de los residuos correspondientes en B. subtilis SpoVE (Glu116Ala, Lys119Asn) afectaron gravemente afectó la eficiencia de la esporulación (Tabla complementaria 3). Las diferencias observadas entre los ensayos in vivo e in vitro sugieren que incluso una actividad in vitro modestamente reducida puede no ser suficiente para mantener la función in vivo y resaltan la importancia de caracterizar los fenotipos mutantes in vivo.

Para que la cadena de glucano se forme y se extienda hacia el sitio activo TP de PBP2, los glucanos unidos a Und-PP en crecimiento (lípidos II, IV, VI, etc.) deben pasar del sitio aceptor (cavidad B) al donante. sitio (cavidad A) en cada ronda de catálisis28. Para que esto ocurra, debe producirse un cambio conformacional en RodA para abrir un pasaje entre las hélices TM 1-2 y 8-10 por un lado, y el haz helicoidal de hélices TM 3-7 por el otro (Fig. 3a). El mapa de densidad crio-EM revela que el haz compuesto por las hélices 3-7 de TM tiene una resolución general más baja que el resto de la proteína, lo que sugiere cierto grado de flexibilidad dentro de esta región (Fig. 3b).

una RodA que se muestra como una cinta coloreada por dominio con las hélices TM 3-7 en rojo y las hélices TM 1-2 y las hélices TM 8-10 en azul. b Resolución local de la región transmembrana del complejo RodA-PBP2 a partir del refinamiento de la resolución local final con una máscara alrededor de la parte transmembrana del complejo. Es evidente que el dominio que consta de las hélices 3-7 de TM en general tiene una resolución local más baja. c Se ilustran rotámeros estéricamente permitidos de etiquetas de espín de nitróxido (R1) para Gly44R1/Asp90R1 en la estructura crio-EM (cadenas laterales de color naranja). d Las distribuciones de distancia DEER resultantes (línea negra sólida) se comparan con las distribuciones de distancia predichas (barras) basadas en los rotámeros estéricamente permitidos que se muestran en las estructuras (coloreados como cadenas laterales).

Utilizamos espectroscopía SDSL DEER para investigar más a fondo esta hipótesis. La distribución de probabilidad resultante de distancias derivada de DEER entre dos etiquetas de espín de nitróxido (MTSL; R1) introducidas en sitios específicos proporciona información sobre el número y la población de estados conformacionales, así como una restricción de distancia para cada uno. Reemplazamos las dos cisteínas nativas en RodA mediante mutagénesis a glicina y alanina (Cys82Gly y Cys133Ala) y confirmamos que el complejo de fusión RodA-PBP2 libre de cisteína se expresaba y era funcional (Figuras complementarias 9a, b). Luego introdujimos un par de etiquetas de espín (Gly44R1 en el extremo periplásmico de la hélice 2 de TM y Asp90R1 en el extremo periplásmico de la hélice 3 de TM) en la fusión de RodA con el fondo libre de cisteína (Fig. 3c y Fig. complementaria 9a-c). . A partir de la distribución de distancia resultante derivada de DEER, se observaron tres poblaciones con distancias dominantes de 26 Å, 35 Å y 45 Å (Fig. 3d y Fig. complementaria 9d, e). Las distancias predichas calculadas agregando rotámeros MTSL estéricamente permitidos a la estructura crio-EM in silico produjeron una distribución de distancia entre 34 y 48 Å (Fig. 3d), alineándose mejor con la población de distancia experimental más larga. Los rotámeros de cadena lateral, que pueden contribuir hasta +/- 8 Å (y contabilizados en el modelado in silico) pueden explicar parcialmente la población de distancia media (centrada en 35 Å). Sin embargo, se necesita un cambio conformacional de la columna vertebral de la estructura crio-EM para muestrear la mayoría de las distancias entre 20 y 35 Å, lo que implica que existen múltiples conformaciones del haz helicoidal. Estas poblaciones tienen distancias más cortas entre Gly44R1 y Asp90R1 que las observadas en el mapa crio-EM, por lo que se necesita más investigación para determinar la estructura y la relevancia fisiológica de estos estados.

Dentro de la región altamente conservada entre las dos cavidades y ubicada centralmente en el bucle periplásmico 4 (PL4) se encuentra Asp262, previamente identificado como un residuo catalítico15,17,29 (Fig. 4a). Para definir mejor el sitio activo, realizamos mutagénesis sistemática de los residuos que rodean a Asp262 y probamos su efecto sobre la función mediante nuestro ensayo bioquímico. De acuerdo con un informe anterior, la mutación de Asp262 a alanina hace que RodA-PBP2 sea enzimáticamente inactivo (Fig. 4b y Fig. Suplementaria 7a). Las mutaciones Glu258Ala, His260Ala o Thr261Ser no afectaron la actividad a pesar del alto grado de conservación y proximidad espacial de estos residuos a Asp262, mientras que la mutación de Pro257, también proximal a Asp262, a alanina resultó en una pérdida completa de la actividad GT (Fig. 4b, Figuras complementarias 6 y 7a). Se observa un fenotipo grave similar cuando se muta el equivalente de Asp262 en nuestro ensayo in vivo de B. subtilis (Asp263Ala) junto con una reducción más modesta de la actividad para el equivalente de Glu258 (Glu259Ala) (Tabla complementaria 3).

un sitio activo RodA con RodA mostrado como cinta verde y PBP2 como cinta azul, los residuos de interés representados como palos. Recorte del gráfico de Weblogo, como en la figura complementaria 6, que se muestra para los residuos de interés, los residuos se representan como barras. La densidad de Cryo-EM en la cavidad A se propuso corresponder a Und-PP mostrado como una superficie amarilla. b Análisis funcional de la actividad de RodA-PBP2 GT mediante el ensayo de polimerización de lípidos II in vitro, monitoreando el efecto de diferentes mutaciones en residuos seleccionados. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. c Representación esquemática del modelo mecanicista de la reacción GT entre dos moléculas de lípido II mediante RodA visto desde el lado periplásmico de la membrana. El sitio activo Asp262 está resaltado en verde.

Con base en nuestras coordenadas modeladas y simuladas del lípido II unido a ambas cavidades (Fig. 5a complementaria), proponemos un mecanismo en el que Asp262 desempeña un papel central para permitir que se produzca la reacción GT (Fig. 4c), análogo a His338 en WaaL26. En nuestro esquema, Asp262 extrae un protón del 4' hidroxilo del Lípido II en la cavidad B. Esta abstracción del protón permitiría que el oxígeno 4' realice un ataque nucleofílico en el carbono 1' de MurNAc del Lípido II en la cavidad A. Esto rompe el enlace entre el carbono y el oxígeno del fosfato dando como resultado un producto Und-PP en la cavidad A y Lípido IV (o Lípido VI, Lípido VII, etc.) en la cavidad B. Nuestras simulaciones MD sugieren que Arg210 en la cavidad A y Arg48 en la cavidad B, así como los residuos de arginina en PL2 (97-111) (Arg101 y Arg109) se acoplan con los grupos de cabeza de pirofosfato del lípido II para coordinar el sustrato dentro del sitio activo. Probamos si la reacción depende del metal, pero no observamos ningún cambio en la actividad al agregar el quelante de iones divalentes EDTA durante el ensayo, lo que indica que la reacción GT catalizada por la fusión RodA-PBP2 de E. coli es independiente del metal (Fig. 7b). Esto contrasta con la familia de enzimas GT51, que incluye PBP de clase A30,31,32.

Probamos la viabilidad del mecanismo propuesto realizando cálculos semiempíricos de unión estrecha funcional de densidad (DFTB) 33 en un modelo de grupo del sitio activo putativo de RodA (Figura complementaria 5a). A partir de estos cálculos, observamos que la formación de lípido IV activada por Asp262 a partir de dos sustratos de lípido II unidos en las cavidades A y B es plausible dadas las limitaciones geométricas de la estructura de RodA como se muestra en nuestras simulaciones atomísticas. Al utilizar cálculos de bandas elásticas empujadas parcialmente convergentes, presentamos la reacción visualmente en la Película complementaria 1. Si bien esto no valida la viabilidad energética del mecanismo propuesto, sí ilustra que la coordinación de los sustratos unidos dentro del sitio activo es geométricamente adecuada. para permitir la reacción.

El mecanismo procesivo de RodA implica el transporte de sustratos desde el sitio aceptor al sitio donante para extender progresivamente la cadena de glicano en crecimiento, hasta que el tallo del pentapéptido principal alcance el sitio TP de PBP234,35. Nuestra estructura contiene un surco que se extiende desde la superficie extracelular del sitio RodA GT hasta el sitio activo PBP2 TP (ver más abajo). El acoplamiento de ligandos y el modelado de diferentes longitudes de la cadena de glicano revelan que el lípido XX (es decir, diez disacáridos) unido a la cavidad A tiene una longitud suficiente para alcanzar el sitio activo de TP y para que el tallo peptídico se conecte al PG ya existente. Hemos modelado que RodA-PBP2 se une secuencialmente al Lípido II, Lípido IV, hasta Lípido XXII y las simulaciones MD muestran que los polisacáridos están coordinados de manera estable dentro de este surco (Figura complementaria 10a). El tallo del pentapéptido parece más móvil cuando no está unido al sitio TP, y las posiciones de las colas de poliprenilo dentro y alrededor de ambas cavidades A y B anclan el PG naciente a la membrana a través de interacciones tanto dentro de la proteína como con la membrana de fosfolípidos (Figura complementaria . 10 a). La porción periplásmica del complejo tiene un RMSF mucho más alto que el dominio TM; sin embargo, la estructura secundaria de RodA-PBP2 es estable durante las simulaciones (Figuras complementarias 5b y 10b).

Al analizar los datos crio-EM, observamos una considerable heterogeneidad estructural entre RodA y PBP2 (Fig. 5a y Fig. complementaria 9n). Para investigar esto más a fondo, realizamos un análisis de variabilidad 3D con una máscara alrededor de PBP2, que tiene la resolución local más baja y parece ser la más móvil de las dos proteínas (Fig. 5a y Fig. Suplementaria 9n). Después de separar las partículas en 6 grupos, observamos una inclinación vertical de ~ 10 ° de PBP2 con respecto a la bicapa, así como una rotación alrededor de PBP2 (Fig. 5a y Fig. complementaria 9n). Para complementar esta observación, realizamos simulaciones MD de RodA-PBP2. De acuerdo con los datos crio-EM, la punta de PBP2, que alberga el sitio activo TP, parece ser muy dinámica en estas simulaciones (Fig. 5c). Para las simulaciones con cadenas de glicano incluidas, especialmente para aquellas con cadenas más largas, observamos un gran cambio conformacional en la parte extracelular de PBP2 que oscila hacia arriba con la punta de PBP2 apuntando en dirección opuesta a la membrana (Figura complementaria 10c). No observamos una conformación extendida como esta en nuestros datos crio-EM, pero como se discutió anteriormente, observamos heterogeneidad en la muestra y descartamos numerosas partículas que pueden adoptar conformaciones más transitorias de PBP2.

a Las dos conformaciones extremas de PBP2 del análisis de variabilidad 3D crio-EM. b RodA-PBP2 se muestra como una cinta coloreada por RMSF en 3 simulaciones MD de 1 μs alineadas con la columna vertebral de RodA, con la cinta aumentando en grosor con mayor RMSF. c Se ilustran rotámeros estéricamente permitidos de etiquetas de espín de nitróxido (R1) para Gly44R1/Gln99R1 en la estructura crio-EM (izquierda; cadenas laterales naranjas) y una estructura de una simulación MD (derecha; cadenas laterales amarillas). d Las distribuciones de distancia DEER resultantes (línea negra sólida) se comparan con las distribuciones de distancia predichas (barras) basadas en los rotámeros estéricamente permitidos que se muestran en las estructuras (coloreados como cadenas laterales).

Para estudiar más a fondo esto, investigamos la dinámica entre PBP2 y RodA con DEER utilizando un par de cisteína diseñado entre el residuo Gly44 en el lado periplásmico de la hélice 2 de TM en RodA y el residuo Gln99 en el dominio principal de PBP2 (residuo 476 en la fusión) ( Figura 5b). PBP2 Gln99 está ubicado en el sitio de unión de MreC propuesto15,23,24, la región donde observamos la mayor variabilidad en los datos crio-EM (Figura complementaria 9n). Este par (Gly44Cys, Gln99Cys) se marcó con una etiqueta giratoria de nitróxido reactivo con cisteína (R1; MTSL), se confirmó que era funcional (Figura complementaria 9n) y se recopilaron datos de DEER. Los datos DEER resultantes para Gly44R1 y Gln99R1 muestran una amplia distribución de distancias que van de 30 a 65 Å (Fig. 5d y Fig. complementaria 9f-h). El residuo Gly44 en RodA se encuentra en una región relativamente estática de la estructura (Figura complementaria 5b), por lo que la mayoría de los movimientos que contribuyen a las distancias DEER probablemente surgen de la dinámica del dominio de la cabeza de unión a MreC de PBP2 y/o potencialmente de la naturaleza dinámica. de todo el dominio soluble de PBP2 con respecto a RodA. Los rotámeros MTSL estéricamente permitidos unidos a residuos de la estructura crio-EM in silico (Fig. 5b) dan como resultado una distribución de distancia calculada que varía de 18 a 40 Å, pero no toman muestras de las distancias más largas de la amplia distribución DEER (Fig. 5d). Además, cuando los rotámeros MTSL se unieron computacionalmente a una estructura de MD (cuadro de 50 ns de la figura complementaria 10c) que tiene una conformación extendida del dominio de la cabeza de PBP2, la distribución de distancia resultante fue de entre 46 y 70 Å (figura 5d). . En comparación, un par DEER dentro del dominio PBP2 (Lys185R1 y Ser330R1) produce una distribución de distancia DEER única más estrecha (Figura complementaria 9i-m). Estos datos respaldan la idea de que la flexibilidad observada entre los dominios RodA y PBP2 probablemente se deba al movimiento del dominio principal con respecto a RodA. En conjunto, estos datos sugieren que la distribución de la distancia DEER no puede explicarse únicamente por los confórmeros de la cadena lateral o pequeñas diferencias en la columna vertebral de la estructura crio-EM y debe representar cambios sustanciales en la conformación de la columna vertebral o del dominio, como se observa en las simulaciones MD.

GT RodA y TP PBP2 constituyen el núcleo del elongasoma de E. coli, el complejo multiproteico que cataliza la formación de la capa esencial de PG. En combinación, nuestros resultados proporcionan hipótesis respaldadas por datos sobre la arquitectura, la catálisis y los reordenamientos estructurales necesarios para la síntesis de peptidoglicanos. La estructura crio-EM identificó dos cavidades principales (A y B) en el lado periplásmico que el análisis MD de grano grueso admite como dos sitios de unión del Lípido II, con la cavidad A y B como el sitio donante y aceptor, respectivamente. En nuestro mapa crio-EM, dentro del sitio donante putativo hay una densidad similar a la de los lípidos, que asignamos tentativamente a Und-PP, un producto de la reacción GT. Las simulaciones MD muestran que Und-PP puede ocupar de manera estable ambas cavidades y que su ocupación promedio se superpone bien con la densidad experimental observada.

Al combinar ensayos funcionales in vitro e in vivo que miden la actividad GT sobre la proteína purificada y la eficiencia de la esporulación en B. subtilis, respectivamente, hemos comenzado a caracterizar el papel de algunos de los residuos más conservados y/o cargados en las cavidades A y B. La homología estructural entre RodA y otras glicosiltransferasas de tipo GT-C que utilizan ligandos acoplados a Und-PP26 sugiere que los residuos cargados positivamente podrían participar en la coordinación del pirofosfato para facilitar su reclutamiento en los sitios de unión o posicionar el sustrato para la catálisis para ocurrir. Algunos, como Arg210, parecen ser esenciales para la función y otros no tanto, lo que refleja quizás el hecho de que la afinidad y especificidad del sustrato están determinadas por múltiples sitios de interacción con la proteína. Es de interés la conservación y la importancia funcional de un triptófano en la posición 102 en PL2 en RodA, que puede desempeñar un papel similar al Trp383 en la celulosa sintasa bacteriana BscA36. En BscA, se propuso que este residuo de triptófano actuara como parte de una “hélice de dedo” que interactúa con los azúcares del sustrato de celulosa, permitiendo un camino para que el polímero de la cadena de glicano en crecimiento salga del sitio activo después de su formación, lo cual es característico de un GT procesivo. enzima37,38. Trp102 en E. coli RodA podría desempeñar un papel análogo en el mecanismo procesivo de polimerización del lípido II. Entre las dos cavidades y uniéndolas, también encontramos el residuo del sitio activo Asp262 y varios residuos conservados que delimitan el sitio activo. Probamos la relevancia funcional de estos residuos tanto in vitro como in vivo, y también demostramos que la reacción GT es independiente del metal. Al combinar estos resultados con cálculos semiempíricos de DFT en el supuesto sitio activo de RodA, proponemos un mecanismo sobre cómo RodA cataliza la reacción entre los dos glicanos unidos a Und-PP (Fig. 6).

Modelado de los diferentes pasos que ocurren durante el alargamiento de la cadena de glicano. Comenzando desde la izquierda, RodA-PBP2 se muestra en complejo con dos moléculas de lípido II. Una vez que estas dos moléculas están conectadas a través de la actividad GT de RodA, Und-PP se libera de la cavidad A, ya sea entre la hélice 7 de TM y el núcleo de RodA, o debajo de las hélices JM hacia la membrana. Hemos modelado que RodA-PBP2 se une secuencialmente al Lípido II, Lípido IV, hasta Lípido XXII, y aquí mostramos diferentes complejos durante el alargamiento hasta que la cadena de glicano alcanza el sitio activo de PBP2. RodA-PBP2 se muestra como representación de superficie en gris. La apertura y el cierre sugeridos previamente de la cabeza y el dominio de anclaje de PBP2 tras la unión de la proteína reguladora MreC no se modelan aquí15,23,24,87. El lípido Und-PP se representa en barras negras y los disacáridos con el tallo pentapéptido adherido en barras de diferentes colores.

Para permitir la procesividad, la creciente cadena de glucano unida a Und-PP debe realizar una transición en cada ciclo catalítico desde el aceptor a la cavidad donante. Con base en la relativa flexibilidad de la estructura como se observa en los mapas crio-EM, planteamos la hipótesis de un movimiento para crear un pasaje entre las hélices 3-7 de TM en un lado y 1-2, 8-10 en el otro para formar un conducto para la cola lipídica de Und-PP. Investigamos esta hipótesis mediante DEER, insertando sondas en mutantes de cisteína, diseñadas en función de la estructura e introducidas en un fondo sin cisteína. Estos experimentos arrojaron resultados consistentes con la flexibilidad del subdominio TM 3-7.

Nuestra estructura sugiere cómo el polímero de glicano en crecimiento puede extenderse desde el sitio RodA GT hasta el sitio activo TP dentro de PBP2 (Fig. 6). Al combinar el modelado de Lípido II, Lípido IV, etc. hasta el Lípido XX con simulaciones MD, determinamos que el glicano en crecimiento es estable dentro del surco que conduce al sitio TP, que la cola de poliprenilo se puede colocar en cualquiera de las cavidades como esta. ocurre, y que una vez sintetizado el Lípido XX, puede tener lugar la reacción TP. Cryo-EM, MD y DEER determinan que PBP2 es dinámica y flexible, lo que podría permitir la acomodación de la cadena de glucano en crecimiento y facilitar su unión a la PG preexistente.

RodA tiene similitudes estructurales con varios GT distintos26, incluida una cavidad de unión a ligando creada por una hélice TM que sobresale del haz helicoidal principal y una hélice anfipática corta que se encuentra paralela a la membrana y que contiene un residuo de arginina altamente conservado, que proporciona coordinación. al producto Und-PP de la reacción26. Las proteínas que conservan este motivo funcional para la unión de Und-PP incluyen la ligasa del antígeno O WaaL26 y otros miembros de la familia GT-C de transferasas y polimerasas dependientes de Und-PP para las cuales hasta hace poco existía una definición estructural deficiente27. La conservación de la secuencia indica claramente que este motivo se conserva en todas las especies. Proponemos que el mecanismo descrito aquí para RodA se conserve en otras proteínas SEDS, incluida B. subtilis SpoVE que sirve como sistema in vivo para el presente estudio.

En resumen, utilizando un enfoque integrado centrado en la estructura crio-EM del complejo RodA-PBP2 de E. coli en el entorno cercano al nativo de un nanodisco, combinado con ensayos bioquímicos, análisis genéticos, simulaciones MD y experimentos DEER, hemos generado un modelo de cómo funciona esta maquinaria procesiva para sintetizar PG. Este trabajo facilitará el diseño de inhibidores basados ​​en estructuras para la actividad GT esencial de RodA y otras polimerasas SEDS Lipid II de las que no se conoce ninguna.

Utilizando la secuencia FtsW de E. coli como semilla, se identificaron por homología 189 ortólogos de proteínas SEDS bacterianas diferentes. Estos ortólogos fueron clonados en una tubería de alto rendimiento con una etiqueta decahistidina en el extremo N o C separada del gen objetivo por un sitio de escisión TEV por científicos de NYCOMPS/COMPPÅ (Consorcio de Nueva York sobre Estructura de Proteínas de Membrana/Centro de Producción y Análisis de Proteínas de Membrana ) ubicado en el Centro de Biología Estructural de Nueva York (NYSBC). Estas dianas fueron analizadas para determinar su expresión y monodispersidad mediante cromatografía de exclusión por tamaño en una variedad de detergentes como se describió anteriormente19,39,40. Se utilizaron cinco dianas SEDS resultantes que eran más favorables para la caracterización estructural para diseñar proteínas de fusión SEDS-PBP, basadas en las fusiones Bacillus subtilis SpoVE-SpoVD y E. coli FtsW-PBP3 caracterizadas genética y funcionalmente previamente13. Se identificaron las parejas PBP de las proteínas SEDS y se amplificaron por PCR a partir de ADN genómico (proporcionado por NYCOMPS/COMPPÅ) de las siguientes cepas bacterianas: Enterococcus faecalis V583, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578, Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655, Streptococcus pneumoniae TIGR4 y Escherichia fergusonii ATCC 35469. Las PBP se insertaron mediante ensamblaje de Gibson41,42 en el extremo C-terminal de los genes SEDS con un conector TSGSGSGS entre el gen SEDS y el gen PBP (consulte la Tabla complementaria 4). El diseño de la construcción se ilustra en la figura complementaria 1a. La secuencia de todos los clones resultantes se verificó mediante secuenciación Sanger (Macrogen). Las ID de UniProt para las proteínas SEDS y las proteínas PBP de las ocho proteínas de fusión únicas se proporcionan a continuación en la Tabla complementaria 1. La fusión de Escherichia coli (RodA UniProt ID 0ABG7; PBP2 UniProt ID P0AD65) en el vector pNYCOMPS-N23 dio como resultado los mejores niveles de expresión y se llevó a cabo para estudios estructurales mediante crio-EM.

La fusión RodA-PBP2 de E. coli en el vector pNYCOMPS-N23 se usó para transformar 50 µl de células competentes BL21(DE3) pLysS E. coli, que se cultivaron durante la noche en 20 ml de medio 2xYT suplementado con 100 µg/ml de ampicilina. y 35 μg/mL de cloranfenicol a 37 °C con agitación a 220 revoluciones por minuto (RPM). Al día siguiente, se inocularon 800 ml de medio 2xYT con 10 ml de cultivo iniciador y se dejaron crecer a 37 °C con agitación a 220 RPM hasta que la DO600 fue de 0,8-1,0. La temperatura se redujo a 22 °C y la expresión de proteínas se indujo con isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 0,2 mM, y el cultivo se incubó durante 4 horas con agitación a 220 RPM. Las células se recogieron mediante centrifugación a 3220 xg durante 15 minutos a 4 °C, se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x y se centrifugaron nuevamente, luego se almacenaron a -80 °C.

Los sedimentos celulares se descongelaron y se resuspendieron en un tampón que contenía ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) 20 mM, pH 7,0, NaCl 200 mM, MgCl2 20 mM, 4 μl/100 ml de RNasa, 10 μg/ml de ADNasa sólida. , cOmpleteTM 1:1000, cóctel inhibidor de proteasa sin EDTA (Roche), tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) 1 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM. Se usó un homogeneizador de vidrio para resuspender los sedimentos celulares usando 6 ml de tampón por cada gramo de masa de sedimento celular. Las células resuspendidas se lisaron pasándolas a través de un homogeneizador Emulsiflex C3 (Avestin) a 15000 psi durante 3 pases. El lisado se ultracentrifugó a 134.000 xg durante 30 minutos a 4 °C. Se descartó el sobrenadante y los sedimentos de membrana se resuspendieron usando un homogeneizador de vidrio en 30 ml de tampón de lavado con alto contenido de sal (HEPES 20 mM, NaCl 500 mM, ADNasa sólida 10 µg/ml, ARNasa 4 µL/100 ml, TCEP 1 mM, cOmpleteTM 1:1000). , cóctel inhibidor de proteasa sin EDTA (Roche), PMSF 1 mM) por 800 ml de cultivo celular. Las membranas resuspendidas se ultracentrifugaron a 134.000 xg durante 30 minutos a 4 °C. Se descartó el sobrenadante y los sedimentos de membrana se resuspendieron y se solubilizaron utilizando un homogeneizador de vidrio y 30 ml de tampón (HEPES 20 mM, pH 7, NaCl 500 mM, 20 % de glicerol, 10 µg/ml de ADNasa sólida, 4 µL/100 ml de ARNasa, 1: 1000 cOmpleteTM, cóctel inhibidor de proteasa sin EDTA (Roche), TCEP 1 mM y PMSF 1 mM y n-dodecil β-D-maltósido al 1% (DDM; Anatrace) por 800 ml de cultivo celular. Las membranas solubilizadoras se mantuvieron girando durante 2 horas a 4 ° C. Posteriormente, la muestra se ultracentrifugó a 134000 xg durante 30 minutos a 4 ° C. El sobrenadante se recoge y se combina con 500 μL de perlas de agarosa Ni-NTA (Qiagen) por cada 800 mL de cultivo celular que se La mezcla gira durante 2 horas a 4 ° C. Luego, las perlas se cargaron en una columna y se lavaron con 10 volúmenes de columna de tampón que contenía HEPES 20 mM, pH 7, NaCl 500 mM, imidazol 60 mM, pH 7,5, glicerol al 20%. y DDM al 0,1%. La proteína se eluyó con 3 volúmenes de columna de tampón que contenía HEPES 20 mM, pH 7, NaCl 500 mM, imidazol 300 mM, pH 7,5, glicerol al 20% y DDM al 0,1%. El imidazol se eliminó de la proteína eluida intercambiando tampón por HEPES 20 mM, pH 7, NaCl 500 mM, glicerol al 20 %, DDM al 0,1 % y TCEP 1 mM usando una columna de desalinización PD-10 (Cytiva). La concentración de la proteína de fusión RodA-PBP2 se midió utilizando un espectrofotómetro de nanogotas (Thermo Fisher). La proteína de fusión RodA-PBP2 se combinó con 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfor-racglicerol (POPG) y proteína de andamio de membrana 1E3D1 en proporciones molares de 1:300:5 respectivamente y se giró durante 2 horas a 4°C. Se agregaron bioperlas (Bio-Rad) a la mezcla, que se dejó rotar a 4 °C durante la noche. Se retiraron las bioperlas y la mezcla se combinó con perlas de agarosa Ni-NTA (el mismo volumen que se usó anteriormente). La mezcla se hizo girar durante 2 horas a 4ºC. Luego, las perlas de Ni-NTA se cargaron en una columna y se lavaron con 10 volúmenes de columna de tampón que contenía HEPES 20 mM, pH 7, NaCl 500 mM e imidazol 60 mM. Los nanodiscos reconstituidos se eluyeron añadiendo 3 volúmenes de columna de tampón que contenía HEPES 20 mM, pH 7, NaCl 500 mM e imidazol 300 mM. La muestra eluida se concentra a 500 µl utilizando un filtro centrífugo MWCO de 100 kDa (Amicon). El complejo de nanodiscos se purificó aún más cargándolo en una columna de exclusión de tamaño 10/300 de aumento Superdex 200 (Cytiva) con un tampón filtrado y desgasificado que contenía HEPES 20 mM, pH 7, NaCl 150 mM y TCEP 1 mM.

El complejo RodA-PBP2 purificado se concentró a 0,66 mg/ml (5,9 µM) usando un concentrador de 100 kDa (Amicon). La muestra se congeló usando un Vitrobot (Thermo Fisher) agregando 3 µL del complejo proteico purificado a una rejilla de oro con agujeros de 0,6/1 µm previamente limpiada con plasma (Gatan Solarus) (Quantifoil UltrAuFoil) y se secó usando papel de filtro 595 (Ted Pella, Inc) durante 7,5 s con una fuerza de transferencia de 3 y un tiempo de espera de 30 segundos a 4 °C con >95% de humedad. Las imágenes se registraron utilizando un microscopio electrónico Titan Krios (FEI), en el Centro de microscopía crioelectrónica de la Universidad de Columbia, equipado con un filtro de energía y una cámara con filtro de detección directa de electrones K3 (Gatan K3-BioQuantum) utilizando un tamaño de píxel de 0,83 Å. Durante la recolección se utilizó un ancho de rendija de filtro de energía de 20 eV y se alineó automáticamente cada hora usando Leginon43. La recopilación de datos se realizó utilizando una dosis de ~58,5 e-/Å2 en 50 fotogramas (50 ms por fotograma) a una tasa de dosis de aproximadamente 16,1 e-/pix/s, utilizando un rango de desenfoque establecido de -1 μm a -2,5 μm. . Se utilizó una apertura de objetivo de 100 µm. Se registraron 11.120 micrografías durante una recolección de dos días.

Los fotogramas de la película se alinearon utilizando Patch Motion Correction implementado en cryoSPARC v.2.1244 usando un factor B durante la alineación de 500. La estimación de la función de transferencia de contraste (CTF) se realizó utilizando Patch CTF implementado en cryoSPARC v.2.12. Se utilizó CrYOLO45 para recoger partículas. La recolección de partículas dio como resultado 3.147.165 partículas que luego se extrajeron en crioSPARC con un tamaño de caja de 400 píxeles agrupados 4 veces. Las partículas se clasificaron usando clasificación 2D en cryoSPARC v.3.2 usando un tamaño de lote por clase de 400 y "Force Max over poses/shifts" desactivado con 40 iteraciones EM en línea y una iteración completa. Se seleccionaron clases 2D con características de alta resolución bien definidas, lo que dio como resultado una pila de partículas de 441.319 partículas. Luego, las partículas se volvieron a extraer utilizando un tamaño de caja de 400 píxeles sin agrupamiento. Se realizó una ronda de reconstrucción ab initio en cryoSPARC v.3.2 utilizando tres clases, con una resolución máxima establecida en 4 Å y una resolución inicial en 9 Å. Esto resultó en dos clases que eran imágenes especulares y una clase con un PBP2 acortado. Luego volvimos a la pila de partículas agrupadas de 3.147.165 partículas y ejecutamos un refinamiento heterogéneo en cryoSPARC v3.2 utilizando las tres clases de la reconstrucción ab initio y dos clases señuelo y un "tamaño de lote por clase" de 30.000. Este refinamiento heterogéneo se ejecutó tres veces utilizando las partículas de las tres clases ab initio del refinamiento heterogéneo anterior como entrada para el siguiente refinamiento heterogéneo. De este refinamiento heterogéneo final se seleccionaron las dos clases superiores (927.369 partículas) y las partículas se volvieron a extraer sin agrupación. A esto le siguió un refinamiento no uniforme con una resolución final de 3,24 Å. Las partículas se clasificaron además mediante refinamiento heterogéneo de dos clases en cryoSPARC v3.2 utilizando el mapa del refinamiento no uniforme de 3,24 Å y un mapa filtrado de paso bajo de 10 Å como entrada. Utilizamos un "tamaño de lote por clase" de 30.000 y una resolución inicial de 5 Å y una "resolución de criterios de convergencia" de 100. A esto le siguió un refinamiento no uniforme con una resolución final de 3,17 Å (600.855 partículas). Para lograr una mayor resolución para la región TM, las partículas se separaron aún más mediante un análisis de variabilidad 3D con una máscara alrededor de la región TM de la proteína excluyendo el nanodisco y una resolución de filtro de 4,5 Å. Las partículas se agruparon en cinco grupos y tres de estos grupos (399.759 partículas) se utilizaron como entrada para un refinamiento no uniforme con una resolución final de 3,10 Å, seguido de un refinamiento local con una máscara alrededor de la región TM de la molécula hasta un resolución final de 2,97 Å para la región TM. Para lograr una mayor resolución para la parte periplásmica de PBP2, utilizamos las 600.855 partículas del refinamiento no uniforme anterior y realizamos un análisis de variabilidad 3D con una máscara alrededor de la parte periplásmica de PBP2. Las partículas se agruparon en diez grupos y los seis mejores grupos se utilizaron como entrada para el refinamiento no uniforme (236.435 partículas) hasta una resolución final de 3,23 Å. A esto le siguió un refinamiento de la inclinación del haz mediante grupos de desplazamiento de imagen, seguido de otro refinamiento no uniforme hasta una resolución final de 3,08 Å. Además, clasificamos las partículas con otra ronda de clasificación 3D en crioSPARC usando cuatro clases, resolución objetivo de 4 Å y maximización de expectativas en línea (O-EM) de 10,000 partículas por épocas. Esto identificó una pila de partículas que refinamos aún más utilizando un refinamiento no uniforme hasta una resolución final de 3,14 Å. Finalmente se realizó un refinamiento local utilizando una máscara alrededor de la región periplásmica hasta una resolución final de 2,95 Å.

El análisis de variabilidad 3D que se muestra en la Fig. 5a se basa en un subconjunto de partículas donde se impuso un refinamiento local con una máscara alrededor de la región transmembrana. A partir de este mapa y con una máscara alrededor de la parte periplásmica de PBP2 se realizó una variabilidad 3D, las partículas se dividieron en 6 clusters.

Se construyó un modelo inicial de RodA y la hélice TM de PBP2 como modelo de homología con la estructura cristalina de rayos X compleja RodA-PBP2 publicada17. El modelo se ajustó al mapa como un cuerpo rígido en Chimera46, posteriormente el modelo se ajustó a la densidad de corriente usando Namdinator21 y se perfeccionó aún más usando Coot47,48,49 y PHENIX50,51 de forma iterativa. Para la parte soluble de PBP2, la estructura de rayos X publicada previamente de la parte soluble de PBP222 se usó como entrada en Namdinator21 y se refinó aún más usando Coot47,48,49 y PHENIX50,51 de forma iterativa.

Se realizó una búsqueda de cavidades utilizando el extractor de solventes del servidor Voss Volume Voxelator52 utilizando un radio de sonda exterior de 10 Å y un radio de sonda interior de 2 Å. Se utilizaron Chimera46, PyMOL y ChimeraX53 para visualizar las estructuras en las figuras.

La versión de lisina dansilada para estudios de visualización en gel de la actividad GT (dansil lisina Lípido II), se produjo mediante recapitulación in vitro de la ruta sintética como se detalló anteriormente54.

La actividad glicosiltransferasa de RodA-PBP2 se demostró mediante la visualización de moléculas de dansil lípido II marcadas fluorescentemente utilizando un método de electroforesis basado en gel de tris-tricina acrilamida55. Se añadió proteína RodA-PBP2 solubilizada con detergente (1,5 µL) a una concentración de 2,7 µM en imidazol 300 mM, NaCl 250 mM, HEPES 20 mM, n-dodecil-BD-maltósido (DDM) al 0,05% y glicerol al 20% a 13,5 µL. tampón de reacción (MgCl2 10 mM, NaCl 100 mM, HEPES 50 mM, DMSO al 20%, óxido de laurildimetilamina (LDAO) al 0,03%, lípido II de dansil lisina 10 μM) hasta una concentración final de proteína de 0,27 μM. La mezcla de reacción se incubó a 37 °C durante 1 h 30 min para permitir la polimerización del lípido II dependiente de RodA.

El polímero Lípido II resultante se desnaturalizó a 95 °C para detener la reacción y se mezcló con tinte de carga 5x (Tris-HCl 50 mM, pH 8,8, SDS al 4 %, glicerol al 40 %, azul de bromofenol al 0,01 %, DTT 200 mM) antes de la electroforesis. en un gel Biorad Criterion al 16,5 % a 110 V durante 80 minutos con tampón de gel anódico (Tris-HCl 0,1 M, pH 8,8) y tampón de gel catódico (Tris-HCl 0,1 M, pH 8,25, tricina 0,1 M, SDS al 0,1 %) . El gel se visualizó mediante una exposición de 10 segundos a los rayos UV en un sistema de imágenes BioRad GelDoc utilizando el software de captura de imágenes Biorad. Los ensayos dependientes de la concentración se realizaron de la misma manera, añadiéndose concentraciones alteradas de RodA-PBP2 o Lípido II. La muestra marcada con MTSL se preparó como se describe en la preparación de muestras de EPR a continuación, antes del ensayo.

El marcaje fluorescente de PBP2 con BocillinTM se realizó incubando fracciones purificadas de 25 μl de RodA-PBP2 con 1 μl de bocilina (1 mg/ml) durante 15 minutos. Las mezclas resultantes se procesaron en un gel de página SDS al 4-15 % y luego se visualizaron durante 4 s utilizando un sistema de documentación en gel BioRad56. Las imágenes se visualizaron al máximo para incluir la escalera de fluoresceína y ningún otro marcador, por lo que solo se visualizaron proteínas teñidas con bocilina en el gel.

Todos los carriles de gel se repitieron al menos tres veces con resultados similares.

La mutagénesis de pNYCOMPS-N23 RodA-PBP2 se realizó utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange II (Agilent) con cebadores personalizados (consulte la Tabla complementaria 4).

Se generó una alineación de secuencia múltiple para RodA utilizando MMseqs257 mediante la búsqueda de proteínas homólogas en UniRef100 y conjuntos de secuencias ambientales. Se utilizó Weblogo358 para analizar y representar la conservación de las secuencias alineadas de RodA como Weblogo, con la secuencia de E. coli K12 W3110 utilizada como referencia. Se utilizó Consurf para representar la conservación de aminoácidos en la superficie de RodA59.

El análisis de coevolución se realizó utilizando GREMLIN60. Las secuencias de E.coli K12 W3110 de RodA (mrdb) y PBP2 (mrdA) se utilizaron como secuencias de entrada para identificar homólogos con un corte de E-10. Sobre la base de esta alineación de secuencias emparejadas, se utilizó GREMLIN, con parámetros predeterminados para encontrar los contactos coevolutivos dentro de RodA o PBP2 y también entre RodA y PBP2.

Dos cisteínas nativas en la fusión RodA-PBP2 de E. coli (vector pNYCOMPS-N23) se mutaron a glicina y alanina (Cys82Gly y Cys133Ala) y luego se introdujeron cisteínas en el fondo libre de cisteína resultante para el marcaje de espín dirigido al sitio (SDSL) en Se supone que los residuos crean distribuciones de distancia informativas mediante espectroscopia DEER EPR en función de la información estructural disponible. Toda la mutagénesis se realizó utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange Lightning (Agilent) o el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange II (Agilent) con cebadores personalizados (consulte la Tabla complementaria 4). Todos los mutantes se probaron para determinar la función enzimática y la unión a bocilina como se describe anteriormente. En preparación para el etiquetado por giro, los mutantes RodA-PBP2 se purificaron en detergente como se describe anteriormente, pero se intercambiaron por un tampón no reductor que contenía HEPES 20 mM, pH 7, NaCl 500 mM, 20 % de glicerol, 0,1 % de DDM utilizando un desalinizador PD-10. columna (Cytiva) después de la elución. Se añadió metanosulfontiolato de S-(2, 2, 5, 5-tetrametil-2,5-dihidro-1H-pirrol-3-il)metilo (MTSL; Santa Cruz Biotechnology) en una proporción molar de MTSL a proteína de 15:1. La reacción se incubó a 4 °C durante la noche con agitación mientras se protegía de la luz. El exceso de etiqueta de centrifugado se eliminó con una columna desalinizadora PD-10 (Cytiva) usando el mismo tampón no reductor. La proteína resultante se concentró hasta 100-150 mM. Para experimentos de EPR de onda continua (CW), se cargaron 7 μl de proteína concentrada en capilares de pyrex (0,6 mm de diámetro interior x 0,84 mm de diámetro exterior; Vitrocom) y se midieron a temperatura ambiente. Para experimentos de EPR pulsada (DEER), se añadió glicerol deuterado a la muestra de proteína concentrada hasta una concentración final del 20% (v/v) y se congelaron 15-20 µL de muestra en tubos capilares de cuarzo (1,6 mm de diámetro exterior x 1,1 mm de diámetro interior). ; Vitrocom) utilizando un baño de hielo seco e isopropanol. Las muestras congeladas se almacenaron a -80 °C hasta que se recogieron los datos de EPR pulsado.

Las mediciones de CW EPR se tomaron utilizando un espectrómetro de onda continua Bruker EMX de banda X con un resonador dieléctrico ER4123D (Bruker Biospin) a temperatura ambiente. Los espectros CW se corrigieron y normalizaron utilizando el software Lab-VIEW (proporcionado por C. Altenbach, Universidad de California en Los Ángeles). Las mediciones de EPR pulsadas (DEER) se tomaron a 50 K con un espectrómetro EPR Bruker E580 de banda Q (Bruker Biospin) equipado con un amplificador de tubo de onda viajera de 300 vatios (Applied Systems Engineering) y un resonador EN5107D2. Se utilizó una secuencia DEER estándar de cuatro pulsos para todas las mediciones con longitudes de pulso p/2 y p que varían según la muestra. La frecuencia de una bomba se establece en el máximo del espectro de nitróxido y la frecuencia observada se establece en 75 MHz más baja. Se utilizaron retrasos crecientes entre pulsos en incrementos de 16 ns con un ciclo de fase de 16 pasos durante la recopilación de datos. Los tiempos de acumulación fueron típicamente entre 12 y 36 horas, con un tiempo de evolución dipolar entre 3 y 3,5 ms. Los datos de evolución dipolar se procesaron utilizando DEERAnalysis61 con ajuste de modelo gaussiano o el complemento de red neuronal DEERNet62. Los rotámeros MTSL se unieron a estructuras obtenidas a partir de datos crio-EM o de simulaciones MD in silico con modelado multiescala de macromoléculas (MMM)63 utilizando la biblioteca de rotámeros predeterminada. Las distancias entre nitróxido y nitróxido se calcularon a partir de las estructuras resultantes y se agruparon en el angstrom más cercano para compararlas con los datos experimentales.

Los ensayos se llevaron a cabo como se describe en Fay et al.13. Brevemente, se introdujeron mutaciones en una construcción SpoVE-SpoVD en una cepa que carecía de spoVD y spoVE y se evaluó la esporulación (sensibilidad al calor).

Se utilizó Autodock vina-carb64 para acoplar Lipid II, Lipid II C55 mDAP y fragmentos de peptidoglicano a las cavidades y grietas identificadas del complejo RodA-PBP2. Las posturas acopladas se convirtieron a CHARMM36m y se minimizó la energía para optimizar las orientaciones de unión y ligar fragmentos acoplados de peptidoglicano para permitir la formación de lípidos polimerizados más largos, por ejemplo, Lípido XX, con parámetros desarrollados en base a los publicados previamente65.

Todas las simulaciones MD de grano grueso (CG) utilizaron el campo de fuerza Martini 366,67. Se generaron topologías Martini 3 con redes elásticas para cadenas de proteínas RodA y PBP2 utilizando Martinize266. El programa DSSP se utilizó para la asignación de estructuras secundarias68, y las constantes de fuerza de la red elástica intracadena se establecieron en 500 kJ mol–1 nm–2 con límites de unión elástica superior e inferior de 1,0 y 0,5 nm, respectivamente.

Los tipos de cuentas de Martini 3 y el mapeo de la molécula de Lípido II se realizaron manualmente, convirtiendo los parámetros de Martini 2 Lípido II publicados previamente69. Los cambios se realizaron de acuerdo con las cuentas de aminoácidos en Martini 367 y los tipos de cuentas sugeridos en el protocolo para crear moléculas pequeñas en Martini 370. Para refinar los parámetros del Lípido II, se realizaron simulaciones atomísticas (3 × 100 ns) utilizando parámetros publicados previamente65 obtenido de los autores en una membrana PE:PG (3:1) con una única copia de Lípido II. También se realizaron simulaciones de CG con la misma composición (5 × 1 μs). Las representaciones de CG y de las moléculas atomísticas del lípido II se muestran en la figura complementaria 5d. Las distribuciones de distancias y ángulos se midieron utilizando las herramientas GMX de distancia y ganglio. Para las simulaciones de todos los átomos, los átomos se agruparon según sus tipos de cuentas y se midió el centro de geometría. El área accesible de la superficie del solvente se midió usando la herramienta gmx sasa. Las parcelas se crearon usando Matplotlib71.

Todos los sistemas modelo se prepararon en cajas periódicas 3D utilizando los métodos Memembed72 e insane73 para generar bicapas simétricas de PE/PG que solvatan proteínas (relación 4:1 de PE:PG). Cuando correspondía, se colocaron dos moléculas de lípido II en posiciones aleatorias en la valva superior (periplásmica). Las dimensiones iniciales de la caja se establecieron en 5,0 nm más el diámetro máximo de la proteína, aproximadamente 11x11x11 nm para RodA y 13x14x15 nm para los sistemas RodA-PBP2. Usando locura, los huecos restantes se llenaron con perlas de agua, con iones de sodio y cloruro en posiciones aleatorias colocadas que representaban una concentración de sal neutralizante de 0,15 M. Luego, los sistemas se sometieron a la minimización del descenso más pronunciado con una tolerancia de Fmax = 100 kJ mol–1 nm– 2. En total, los sistemas RodA y RodA-PBP2 constaban de aproximadamente 11.000 y 24.000 cuentas, respectivamente.

Todas las simulaciones de CG de producción se realizaron utilizando GROMACS 202174 utilizando el integrador de salto incorporado con un paso de tiempo de 0,02 ps, a menos que se indique lo contrario. Todas las simulaciones de producción tomaron muestras de conjuntos isotérmicos-isobáricos a 310 K utilizando el termostato de reescala V (τt = 1,0)75 y el barostato de reescala C para acoplamiento de presión semiisotrópica a 1,0 bar (τp = 12,0)76. Las ejecuciones de equilibrio de preproducción utilizaron el barostato Berendsen y un paso de tiempo de 0,01 ps. Se usaron grupos de acoplamiento separados para moléculas de proteínas, lípidos y disolventes (es decir, aguas e iones). Para la electrostática, se utilizó el método del campo de reacción con un límite de Coulomb de 1,1 nm (εr = 15 y εr = ∞ para r > 1,1 nm), y las interacciones de van der Waals (VdW) también utilizaron un límite de 1,1 nm (ambos con el esquema de corte de Verlet). El algoritmo P-LINCS ampliado hasta el cuarto orden se utilizó para el tratamiento de restricciones holonómicas77. Cada sistema se equilibró durante 10 ns, después de lo cual se prepararon ciclos de producción de 10 μs a partir de las coordenadas y velocidades de los cuadros finales de las trayectorias de equilibrio. Para RodA y RodA-PBP2, se realizaron 50 repeticiones de las simulaciones de producción.

Los mapas de densidad para la simulación MD en la Fig. 3d se prepararon concatenando todas las trayectorias repetidas centradas en RodA, luego se ajustaron los mínimos cuadrados a las cuentas de la columna vertebral de RodA (usando MDanalysis78) y usando la biblioteca PLUMED79 de código abierto desarrollada por la comunidad para registrar la x y coordenadas y de los centros geométricos de las perlas de fosfato de Lípido II. Debido a la orientación estándar de la proteína en la bicapa (de Memembed), el eje z de la caja de simulación siempre es perpendicular al plano de la membrana y el histograma resultante de las coordenadas x e y es funcionalmente una proyección 2D orientada hacia la bicapa de la densidad de partículas. Se utilizó el API seaborn para realizar la estimación de la densidad del grano presentada en las cifras finales. El análisis de interacción del lípido II se realizó utilizando PyLipID25 para identificar sitios de unión, residuos que interactúan y tiempos de ocupación para las moléculas del lípido II unidas de las simulaciones de CG.

Las simulaciones atomísticas para apo RodA y RodA-PBP2 se configuraron utilizando el mismo proceso que las simulaciones CG, excepto que se utilizó el campo de fuerza Martini 2.266 y restricciones de posición para perlas de proteína con constantes de fuerza establecidas en 1000 kJ mol–1 nm–2. Después de 50 ns de equilibrio de CG, los sistemas de CG se convirtieron en sistemas atomísticos utilizando el programa CG2AT con el método de "alineación" incorporado para dirigir la geometría de la proteína hacia la estructura EM preparada (pre-relajación de CG) durante la conversión80. La alineación sugirió un RMSD típico de sólo 0,14 nm durante el transcurso del equilibrio del CG. En general, este protocolo permitió la preparación de sistemas de proteínas de membrana de todos los átomos en bicapas bien equilibradas.

Cuando fue relevante, el lípido II y sus formas polimerizadas (es decir, lípido IV, lípido XX, etc.) se agregaron a los sistemas atomísticos después de la conversión (es decir, antes del equilibrio atomístico) alineando y minimizando la energía de las conformaciones acopladas en las dos cavidades de unión observadas ( A y B).

Las simulaciones de producción consistieron en tres repeticiones de 500 ns, cada una de las cuales continuó desde una trayectoria de equilibrio distinta. El sistema que representa la estructura crio-EM de RodA-PBP2 con Und-PP unido se simuló durante tres repeticiones de 1 μs cada una. Todas las simulaciones atomísticas utilizaron el integrador de salto GROMACS 2021 con un paso de tiempo de 0,002 ps, el campo de fuerza CHARMM36m81 y el modelo de agua TIP3P82,83. Las simulaciones se realizaron en el conjunto isotérmico-isobárico a 310 K con el termostato de reescala V (τt = 0,1) y el barostato Parrinello-Rahman para acoplamiento de presión semiisotrópica a 1,0 bar (τp = 1,0)84,85. Se utilizó la malla de partículas Ewald (PME) para el tratamiento de la electrostática86, y las interacciones VDW utilizaron un límite (Verlet) de 1,2 nm. Todos los enlaces que involucran hidrógenos se convirtieron en restricciones holonómicas que se trataron con el algoritmo P-LINCS de cuarto orden.

Para el mapa de calor dinámico de PBP2 en la Fig. 4, cada simulación de producción de apo RodA-PBP2 se ajustó mediante el método cuadrático medio a RodA en el primer cuadro de trayectoria usando MDAnalysis antes del cálculo de los factores B simulados usando la utilidad GROMACS gmx rmsf. Los valores presentados en la figura final provienen del promedio de las cinco simulaciones repetidas y se han asignado a la estructura RodA-PBP2 minimizada antes del equilibrio.

Se creó una interpolación lineal de la polimerización del Lípido II utilizando la herramienta GROMACS gmx morph. Esta película ilustra el alargamiento de PG, los posibles cambios conformacionales de RodA asociados con la polimerización y la posible transición de productos unidos a lípidos de la cavidad B a la cavidad A para permitir que se una el siguiente lípido II.

A partir de las simulaciones atomísticas de MD con lípidos II-VI unidos, los marcos de trayectoria se filtraron basándose en cortes de distancia simples de 6,5 Å entre D262, el resto hidroxilo C4 del lípido B del sitio (donante) y el átomo del lípido C1 (aceptor) del sitio A. para resaltar geometrías iniciales adecuadas de los átomos catalíticamente relevantes. A partir de estos, se utilizaron instantáneas seleccionadas para construir modelos de conglomerados para minimizaciones de gestión de calidad. Los átomos de QM incluían una región en forma de losa de RodA que rodeaba a D262 y los grupos de cabeza de lípidos unidos en cada sitio. Los átomos de RodA consistían en 6 fragmentos peptídicos completos separados que abarcaban los residuos R48-K49, K97-W102, R109-Q111, D159-L160, E258-F263 y S340-G343. Para cada molécula de sustrato, se incluyeron dos unidades de glucano completas (GlcNAc-MurNAc) (es decir, lípido II), pero las colas de lípidos de undecaprenilo se truncaron después del primer fragmento de isoprenilo y, de manera similar, las cadenas de pentapéptido se truncaron en el átomo de L-Ala Cα (incluido el cadena lateral). Al definir los límites de los fragmentos peptídicos, sólo se cortaron los enlaces (no polares) entre los átomos de carbono de la cadena principal, por lo que siempre se hicieron cortes entre los carbonos Cα y amida (carbonilo) en ambos extremos (de modo que los extremos N-terminales de los fragmentos siempre contienen el resto carbonilo del residuo anterior). Todos los enlaces cortados se taparon con átomos de hidrógeno agregados y todos los átomos límite se fijaron en su lugar durante las optimizaciones (es decir, con coordenadas cartesianas congeladas). En general, el modelo de clúster constaba de 590 átomos en total, con una carga global de -1 y multiplicidad singulete. Todos los cálculos de QM informados se realizaron utilizando el programa ORCA (versión 5.0.3) y la densidad funcional semiempírica GFN2-xTB con solvatación implícita ALPB (agua). Para obtener estructuras de productos a partir de estructuras de reactivos, las minimizaciones se dirigieron con restricciones armónicas seleccionadas que extendieron el enlace del grupo saliente del pirofosfato y tiraron a lo largo de la coordenada que forma el enlace glicosídico, después de lo cual la geometría del grupo se volvió a relajar sin las restricciones, convergiendo en el producto más cercano. mínimo. El vídeo complementario se interpola a partir de un cálculo NEB parcialmente convergente que consta de 8 imágenes que conectan las geometrías del producto y del reactivo minimizadas a partir de una instantánea representativa.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los mapas de densidad se han depositado en el Banco de datos de microscopía electrónica (EMDB), con el código de acceso EMD-41303, EMD-41304 y EMD-41299. El modelo ha sido depositado en el Protein Data Bank (PDB), con el código de acceso 8TJ3. Todos los datos están disponibles en el manuscrito o en los materiales complementarios. Los datos de origen se proporcionan con este documento en el archivo de datos de origen. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención NIGMS R35GM132120 (para FM), R35GM141953 (JD), R35GM131829 (LC) y F32GM136076 (MBD). DIR fue financiado por un premio del Programa Schaefer Research Scholars otorgado a la Universidad de Columbia, la subvención BB/N003241/1 del Consejo de Investigación en Ciencias Biológicas (BBSRC) y la subvención MR/N002679/1 del Consejo de Investigación Médica (MRC). La investigación en el laboratorio de PJS está financiada por Wellcome (208361/Z/17/Z), MRC (MR/S009213/1) y BBSRC (BB/P01948X/1, BB/R002517/1 y BB/S003339/1). La beca de JJD fue patrocinada por el MRC (MR/N014294/1) y las becas para NSB y CLBG fueron patrocinadas por el BBSRC (BB/M01116X/1). CLBG también recibió financiación de la subvención NERC NE/T014717/1 y de Antibiotic Research UK Charity. La beca del CMB está patrocinada por el MRC (MR/N014294/1). Este proyecto aprovechó el tiempo en ARCHER y JADE concedido a través del Consorcio de Computación de Alta Gama para Simulación Biomolecular del Reino Unido, HECBioSim (http://hecbiosim.ac.uk), con el apoyo de EPSRC (subvención nº EP/R029407/1). PJS reconoce a Sulis en HPC Midlands +, que fue financiado por EPSRC con la subvención EP/T022108/1, y la Plataforma de Tecnología de Investigación en Computación Científica de la Universidad de Warwick por el acceso computacional.

Departamento de Fisiología y Biofísica Celular, Centro Médico Irving de la Universidad de Columbia, Nueva York, NY, 10032, EE. UU.

Rie Nygaard, Joseph Pepe, Silvia Corradi, Khuram U. Ashraf, Oliver B. Clarke y Filippo Mancia

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Oliver B. Clarke

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MBD llevó a cabo el diseño de la fusión SEDS-PBP y la clonación con la ayuda de JD y BKRN, expresión optimizada de la construcción RodA-PBP2 de E. coli con la ayuda de la proteína purificada KA, SC y MBDRN para muestra crio-EM. RN recopiló y analizó los datos crio-EM. RN construyó el modelo con la ayuda de CLBG y OBC La edición genética para ensayos funcionales de E. coli fue realizada por CLBG y JP, CLBG y NB realizaron la expresión y purificación de proteínas para ensayos funcionales de E. coli. CLBG llevó a cabo ensayos funcionales de polimerización de lípidos II in vitro en E. coli. La edición genética para B. subtilis fue realizada por MAH y JD. Los ensayos de esporulación de B. subtilis in vivo fueron realizados por MAH con la supervisión de JD. Todas las simulaciones MD fueron realizadas por PJS. y JDC, con algunos scripts proporcionados por OV, los parámetros para la dinámica de Lipid II fueron diseñados por CMB Autodock. Los experimentos de unión de Lipid II fueron realizados por CMB y CLBG. El sustrato de Lipid II fue sintetizado por CLBG y JJD. El análisis de coevolución fue realizado por PJS y CLBG. MBD y CLBG realizaron la edición de genes para experimentos de DEER, y MBD recopiló y analizó los datos de DEER bajo la supervisión de experimentos diseñados por LCRN, CLBG, MBD, BB, JDC, PJS, LC, JD, FM y DIR y RN, CLBG, MBD, JDC, PJS, LC, JD, FM y DIR escribieron el artículo. La supervisión de todo el proyecto estuvo a cargo de FM.

Correspondencia a Linda Columbus, Jonathan Dworkin, Phillip J. Stansfeld, David I. Roper o Filippo Mancia.

Los autores no declaran ningún interés en competencia.

Nature Communications agradece a Konstantinos Beis y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Nygaard, R., Graham, CLB, Belcher Dufrisne, M. et al. Base estructural de la síntesis de peptidoglicanos por el complejo RodA-PBP2 de E. coli. Nat Comuna 14, 5151 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40483-8

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Recibido: 11 de noviembre de 2022

Aceptado: 31 de julio de 2023

Publicado: 24 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40483-8

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