Investigación de la Universidad de Kanazawa: los investigadores definen un protocolo de fabricación de nanopipetas para obtener imágenes celulares de alta resolución

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22 de agosto de 2023, 4:03 a. m. ET

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KANAZAWA, Japón, 22 de agosto de 2023 /PRNewswire/ -- Investigadores de la Universidad de Kanazawa informan en Analytical Chemistry cómo producir nanopipetas que proporcionen de manera confiable imágenes de microscopía de conductancia iónica de barrido con resolución a nanoescala de células vivas.

Una visión a nanoescala de las células vivas puede proporcionar información valiosa sobre la estructura y función de las células. A lo largo de los años, se han utilizado diversas técnicas de microscopía para obtener una ventana a especímenes biológicos a nanoescala, pero todas con sus limitaciones y desafíos. Aunque la microscopía de conductancia iónica de barrido (SICM) ha demostrado la capacidad de obtener imágenes de muestras biológicas vivas en solución con resolución a nanoescala, se ha visto obstaculizada por desafíos para producir nanopipetas de manera confiable con la geometría óptima para el trabajo. Ahora, investigadores dirigidos por Yasufumi Takahashi en Nano LSI de la Universidad de Kanazawa y la Universidad de Nagoya han ideado un protocolo para fabricar nanopipetas de forma reproducible con la geometría preferida para obtener imágenes de alta calidad. La microscopía de conductancia iónica de barrido (SICM) utiliza una nanopipeta para controlar la distancia nanopipeta-muestras utilizando una corriente iónica como señal de retroalimentación. La forma de la nanopipeta influye significativamente en el rendimiento del dispositivo. Por ejemplo, una apertura amplia limita la posible resolución, una derivación larga puede provocar efectos de rectificación que deformen las mediciones de la corriente iónica, y si el vidrio de la nanopipeta es demasiado grueso puede deformar la muestra antes de que la proximidad de la apertura haya alcanzado el Punto necesario para el mapeo topográfico de corriente iónica constante. Como resultado, la nanopipeta ideal tiene una derivación corta, una apertura pequeña y paredes de vidrio delgadas.

El procedimiento estándar para fabricar la nanopipeta es extraer un tubo capilar con un extractor láser que calienta el tubo capilar que está manipulando. Luego, el capilar se estrecha donde se alarga hasta que finalmente se divide en dos piezas separadas. Aunque el cuarzo puede permitir un poco más de control en el proceso de darle forma al tubo capilar, es hidrófobo, lo que plantea complicaciones a la hora de llenar la nanopipeta con la solución acuosa necesaria para la corriente iónica. Por este motivo, los investigadores desarrollaron un protocolo mediante el cual podían extraer nanopipetas de capilares de vidrio de borosilicato con el control y la reproducibilidad requeridos.

Takahashi y sus colaboradores observaron que, idealmente, el capilar inicial debería tener paredes gruesas y un diámetro interior estrecho; sin embargo, no es fácil obtener tubos capilares que cumplan estos requisitos de proveedores comerciales. En cambio, precalientan el capilar durante 5 s sin tirar de él, lo que hace que las paredes de vidrio se espesen y reduzcan el diámetro interior. También optimizaron los parámetros para tirar del tubo, como la velocidad.

Los investigadores demostraron el rendimiento de las nanopipetas que produjeron al obtener imágenes de una célula que sufre un tipo de endocitosis, donde envuelve y absorbe algo de material externo. Pudieron obtener imágenes de las microvellosidades (protuberancia de la membrana celular) en la superficie celular, los hoyos endocíticos que se forman y la formación de una tapa que cierra el hoyo. Los intentos anteriores de obtener imágenes de la formación de la capa se han visto inhibidos por limitaciones en la resolución espacial.

Los investigadores incluso pudieron resolver vesículas extracelulares de hasta 189 nm liberadas en el proceso. Como señalan en su informe, cada vez hay más pruebas de que estas vesículas extracelulares desempeñan un papel importante en la comunicación entre las células y la homeostasis, con aplicaciones diagnósticas y terapéuticas centradas en las vesículas extracelulares más pequeñas, entre 40 nm y 150 nm en particular. Los investigadores concluyen en su informe: "Prevemos que este protocolo ayudará a fabricar de forma reproducible nanopipetas de borosilicato para mapeo topográfico de alta resolución utilizando SICM".

Leyenda: Fig 1. Nuevo método para fabricar nanopipetas e imágenes de ultra alta resolución de su forma. Arriba a la izquierda: capilar de vidrio después del precalentamiento para deformar el vidrio. Abajo a la izquierda: micrografía electrónica de la punta de una nanopipeta; Derecha: imagen SICM de la superficie de una célula HeLa fija.

Glosario

Microscopía de conductancia iónica de barrido

El principio básico detrás de la microscopía de conductancia iónica de barrido (SICM) se basa en monitorear la corriente iónica que fluye a través de una nanopipeta que contiene algún tipo de electrolito. Puede mapear la topografía de una muestra ajustando la altura de la nanopipeta para mantener una corriente iónica constante mientras se escanea sobre la superficie de la muestra. La proximidad a la superficie de la muestra tiene un efecto mensurable en el flujo de iones y, por tanto, en la corriente antes de que la punta entre en contacto con la muestra, lo que la hace útil para muestras biológicas que podrían dañarse fácilmente. También funciona bien en solución, mientras que técnicas como la microscopía electrónica requieren que la muestra esté fijada.

SICM se ha utilizado en modo de salto, donde la pipeta se acerca y se retrae de la muestra, lo que reduce aún más la posibilidad de dañar la muestra, particularmente cuando la superficie de la muestra no es plana. Sin embargo, lleva más tiempo debido a las distancias verticales recorridas por la nanopipeta y puede sufrir más ruido. En este informe, los autores demostraron que sus nanopipetas de alto rendimiento eliminaron la necesidad de realizar mediciones en modo de salto para sus muestras.

vesícula extracelular

Se trata de partículas unidas por una bicapa lipídica que todas las células producen, aunque, a diferencia de una célula, no se reproducen por sí mismas. Ha habido un reciente aumento de interés en ellos a medida que los estudios revelan su posible papel en la transferencia de señales, lo que ha llevado a que se los describa como un "nuevo sistema crino" en analogía con el sistema endocrino que secreta hormonas para enviar señales por todo el cuerpo. .

ReferenciaYasufumi Takahashi, Yuya Sasaki, Takeshi Yoshida, Honda Kota, Yuanshu Zhou, Takafumi Miyamoto, Tomoko Motoo, Hiroki Higashi, Andrew Shevchuk, Yuri Korchev, Hiroki Ida, Rikinari Hanayama, Takeshi Fukuma Pautas de fabricación de nanopipetas para imágenes a nanoescala SICM, química analítica Agosto 20, 2023.DOI:10.1021/acs.analchem.3c01010URL: https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c01010

ContactoHiroe YonedaEspecialista senior en planificación y extensión de proyectosOficina administrativa de NanoLSIWPI Nano Life Science Institute (WPI-NanoLSI)Universidad de KanazawaKakuma-machi, Kanazawa 920-1192, JapónEmail: [email protected]Tel: +81 (76) 234-4550

Acerca del Instituto de Ciencias de la Vida Nano (WPI-NanoLSI)

Nano Life Science Institute (NanoLSI) de la Universidad de Kanazawa es un centro de investigación establecido en 2017 como parte de la Iniciativa del Centro de Investigación Internacional Premier Mundial del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología. El objetivo de esta iniciativa es formar centros de investigación de nivel mundial. NanoLSI combina los conocimientos más avanzados de la microscopía de sonda de barrido biológico para establecer "técnicas nanoendoscópicas" para obtener imágenes, analizar y manipular biomoléculas directamente para obtener información sobre los mecanismos que rigen los fenómenos de la vida, como las enfermedades.

https://nanolsi.kanazawa-u.ac.jp/en/

Acerca de la Universidad de Kanazawa

Como universidad integral líder en la costa del Mar de Japón, la Universidad de Kanazawa ha contribuido en gran medida a la educación superior y la investigación académica en Japón desde su fundación en 1949. La Universidad tiene tres facultades y 17 escuelas que ofrecen cursos en materias que incluyen medicina e ingeniería informática. y humanidades.

La Universidad está ubicada en la costa del Mar de Japón en Kanazawa, una ciudad rica en historia y cultura. La ciudad de Kanazawa tiene un perfil intelectual muy respetado desde la época del feudo (1598-1867). La Universidad de Kanazawa está dividida en dos campus principales: Kakuma y Takaramachi para sus aproximadamente 10.200 estudiantes, incluidos 600 extranjeros.

http://www.kanazawa-u.ac.jp/e/

FUENTE Universidad de Kanazawa

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